严重烫伤小鼠主要器官自噬变化的实验研究

孙春红，陈 刚，王凤君，闫柏刚

0 引 言

自噬(Autophagy)即自体吞噬，是生物体通过溶酶体或囊泡降解胞内成分的总称，系指来源于粗面内质网无核糖体附着区的双层膜包裹部分胞质和细胞内需要降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，从而实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新［1-2］。目前的研究认为，自噬不仅在细胞生长与发育中起重要作用，而且在应对各种应激及多种疾病如缺血缺氧性损害、炎症反应等的发生与发展中也发挥着关键作用［2-6］。但严重烧伤后器官组织细胞的具体自噬情况，以及在烧伤后器官结构和功能的改变中发挥何种作用，目前尚无相关研究资料。本研究利用BALB/C小鼠建立30%TBSA的Ⅲ度体表烫伤模型，动态观察严重烫伤早期心、肝、肺、肾实质器官细胞自噬的变化，旨在了解严重烧伤对组织细胞自噬的影响，为进一步研究自噬在严重烧伤后器官结构与功能损害中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 BALB/C小鼠购自第三军医大学实验动物中心，合格证号:SYXK(渝)20120002。LC3B抗体、Beclin 1抗体均购自美国Sigma公司;全蛋白提取试剂盒购自凯基生物;辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记二抗为美国Southern Biotech公司产品;超敏化学发光试剂盒由美国GE公司提供;蛋白测定试剂盒、小型垂直电泳仪、电转仪、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜、蛋白印迹相关试剂及ChemiDoc XRS型凝胶图像分析系统为美国Bio-Rad公司产品;H-600型透射电镜购自日本日立公司。

1.2 小鼠Ⅲ度烫伤模型的制作 选取6～8周龄的清洁级BALB/C小鼠24只，雌雄不拘，体重20～25g，饲养环境(22±2)℃，常规饲料喂养，自由饮水。将24只小鼠简单随机分组法分成6组，每组4只，即烫伤前(正常对照)组、烫伤后1 h组、2 h组、6 h组、12 h组和24 h组。所有小鼠均用剃推剪和8%硫化钠去除背部毛发。除烫伤前组外，其余5组的20只小鼠于90℃水浴锅中烫伤已脱毛的背部皮肤10 s，造成30%TBSA的Ⅲ度烫伤(经病理切片证实)，伤后立即腹腔注射1 mL等渗盐水，自由进食水。取各组小鼠心、肝、肺、肾器官组织标本，分别用2.5%戊二醛保存用于透射电镜或液氮保存待用于蛋白表达分析。

1.3 指标检测与方法

1.3.1 器官组织Beclin 1与LC3蛋白表达的检测采用蛋白免疫印迹法检测Beclin 1与LC3蛋白表达，方法简述如下:用全蛋白提取试剂盒提取各器官组织全蛋白提取物，取上清用RC DC蛋白测定试剂盒测定蛋白含量。所提取蛋白经100℃水浴5 min后，进行8%～12%SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜。以5%脱脂奶室温封闭1 h，向PVDF膜滴加Beclin 1或LC3一抗(稀释度为1∶1000)，以β肌动蛋白作内参(稀释度为1∶5000)。4℃孵育过夜后，用TBST洗膜4次，滴加经1∶5000稀释的HRP-羊抗鼠IgG或HRP-羊抗兔IgG，室温孵育1 h。用 TBST洗膜4次后，用化学发光试剂盒检测，经ChemiDoc XRS型凝胶图像分析系统采集信号。Quantity One软件进行相对定量分析，LC3的相对表达量是以LC3Ⅰ与LC3Ⅱ的比值表示，Beclin 1的相对表达量是以其与内参β肌动蛋白的比值表示。

1.3.2 透射电镜检测自噬 器官组织用2.5%戊二醛(磷酸缓冲液配制，pH 7.2～7.4)于4℃固定2～4 h，0.1 mol/L 磷酸缓冲液漂洗(30 min/次 × 2次)，1%锇酸4℃固定2 h。固定后的样本经丙酮梯度脱水后，用丙酮:环氧树脂1∶1浸泡1h，在40℃烤箱中先后用纯包埋剂和包埋剂分别处理2 h。最后用环氧树脂618包埋半薄切片定位、超薄切片，铅染色，置于电镜下观察拍照。

1.4 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，定量数据以均数±标准差(±s)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett-t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 烫伤后各器官组织自噬相关蛋白Beclin 1和LC3表达的变化 与烫伤前组相比较，小鼠烫伤后1 h心、肝、肺、肾组织Beclin 1及LC3蛋白表达均开始逐渐增加，肝、肺、肾组织Beclin 1及LC3蛋白表达于伤后12 h达高峰，随后回落，但至伤后24 h时仍高于正常对照。心组织Beclin 1及LC3蛋白表达则是持续性逐渐增加，至伤后24 h时仍显著高于正常对照。见表1、表2。免疫印迹结果见图1、图2。

表1 烫伤前后各器官组织Beclin 1蛋白表达的动态变化(±s，n=4)Table 1 Beclin-1 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald(±s，n=4)

表1 烫伤前后各器官组织Beclin 1蛋白表达的动态变化(±s，n=4)Table 1 Beclin-1 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald(±s，n=4)

与烫伤前比较，*P ＜0.05

器 官不同时间Beclin 1 24 h心0.60 ±0.16 0.70 ±0.19 0.96 ±0.09* 1.02 ±0.06* 1.18 ±0.05* 1.68 ±0.54蛋白表达量烫伤前 烫伤后1 h 烫伤后2 h 烫伤后6 h 烫伤后12 h 烫伤后*肝0.65 ±0.20 0.95 ±0.11* 0.99 ±0.10* 1.21 ±0.13* 1.37 ±0.18* 0.81 ±0.23肺0.80 ±0.07 0.88 ±0.08 1.00 ±0.05* 1.10 ±0.07* 1.27 ±0.06* 1.00 ±0.17肾0.70 ±0.14 0.82 ±0.12 0.95 ±0.13* 1.16 ±0.12* 1.51 ±0.20*0.87 ±0.21

表2 烫伤前后各器官组织LC3蛋白表达的动态变化(±s，n=4)Table 2 LC3 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald(±s，n=4)

表2 烫伤前后各器官组织LC3蛋白表达的动态变化(±s，n=4)Table 2 LC3 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald(±s，n=4)

与烫伤前比较，*P ＜0.05

器 官不同时间LC3 24 h心2.58 ±0.93 3.48 ±1.25 4.25 ±1.55* 4.38 ±1.69* 5.20 ±1.83* 6.08 ±2.04蛋白表达量烫伤前 烫伤后1 h 烫伤后2 h 烫伤后6 h 烫伤后12 h 烫伤后*肝0.91 ±0.24 1.24 ±0.52 1.35 ±0.43* 1.60 ±0.44* 2.03 ±0.57* 1.03 ±0.37肺0.87 ±0.29 1.12 ±0.27 1.20 ±0.33* 1.30 ±0.45* 1.66 ±0.59* 1.19 ±0.38肾0.68 ±0.21 1.05 ±0.41 1.39 ±0.57* 1.48 ±0.71* 2.12 ±0.75*1.01 ±0.17

图1 烫伤前后各器官Beclin 1蛋白表达Figure 1 Beclin-1 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald

图2 烫伤前后各器官LC3蛋白表达的变化Figure 2 LC3 protein expression in the internal organs of the mice before and after scald

2.2 透射电镜变化 透射电镜观察是目前确定自噬的重要形态学指标，为此我们利用透射电镜观察了烫伤前后心、肝、肺、肾组织细胞自噬的变化，结果见图3。与烫伤前组相比较，烫伤后6 h时心、肝、肺、肾组织胞内均出现自噬溶酶体增多，即细胞自噬增加。

图3 烫伤前后各器官细胞自噬的变化Figure 3 Autophagy in the internal organs of the mice before and after scald

3 讨 论

众所周知，严重烧伤早期的病理生理变化极其复杂，常常发生应激反应、休克、缺血缺氧性损害、炎症反应、免疫功能紊乱、高代谢反应等病理生理反应，而且这些病理生理反应又常交替并相互影响，最终导致各器官结构与功能受损，严重时常发生多器官功能不全综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。有研究资料表明［7-9］，严重烧伤后MODS的发生率高达28.1%，一旦发生极难逆转，病死率达78%～98%。虽然近年来烧伤综合救治水平在不断提高，但严重烧伤后MODS的防治仍然是当前烧伤临床所面临的一道难题。究其根本原因，可能主要与对严重烧伤后器官组织结构与功能损害的发生机制仍不完全清楚有关。

过去大量的研究表明［10-12］，烧伤可通过多种因素引起Ⅰ型程序性细胞死亡即凋亡增加，且细胞凋亡在烧伤后器官组织结构及功能损害或MODS的发生中具有重要作用。那么，同属于程序性细胞死亡的Ⅱ型程序性细胞死亡即自噬在严重烧伤后是否也发生变化呢?目前的研究尚不清楚。为此，本实验观察了小鼠严重烫伤早期心、肝、肺、肾实质器官组织细胞自噬的动态变化。结果表明:小鼠遭受30%TBSA的Ⅲ度烫伤后，作为自噬重要标记分子的Beclin 1及LC3在心、肝、肺、肾组织的蛋白表达于伤后1 h即开始增加，且随着伤后时间的延长更进一步增加，肝、肺、肾组织Beclin 1及LC3蛋白表达于12h达高峰，随后回落，但至24 h时仍高于伤前，心组织Beclin 1及LC3蛋白表达更是持续性逐渐增加。既往的研究资料表明［13-14］，自噬的发生受到多种自噬相关基因的调控，其中Beclin 1与LC3在自噬小体的形成过程中均发挥着不可缺少的重要作用，它们表达水平的上调可以促进自噬的发生，被认为是自噬形成的标志性分子。因此，小鼠严重烫伤后各器官组织Beclin 1与LC3蛋白表达水平升高，表明组织细胞自噬增加。同时，本实验的透射电镜结果也显示严重烫伤小鼠心、肝、肺、肾组织自噬溶酶体增多，与上述的自噬相关蛋白Beclin 1和LC3结果一致。综合来看，小鼠严重烫伤后心、肝、肺、肾组织细胞自噬明显增加。至于小鼠烫伤后24 h时心脏组织Beclin 1与 LC3表达持续上升，而肝、肺、肾组织Beclin 1与LC3表达则回落的原因，目前尚不清楚，推测可能与器官自身的组织学结构、缺血缺氧程度、信号通路、炎性细胞因子水平、活性氧产生不同等有关，但仍有待证实。

严重烧伤后器官组织自噬增加的意义目前尚难以确定。过去的研究认为［15-17］，自噬在细胞存活与死亡中是把双刃剑，对细胞的存活和死亡都有作用。适度自噬是细胞进行自身代谢和细胞器更新的一种重要方式，利于细胞存活，对维持机体内环境稳定以及调控细胞损伤有重要意义;但过度自噬则会引起细胞过多死亡，从而引起组织器官损害。最近有研究资料表明［18］，SD大鼠遭受30%TBSA的Ⅲ度烫伤后的12 h内心肌细胞自噬显著增强，从而使心肌细胞过度死亡，导致心功能降低，而抑制自噬可减轻心功能损害。这一研究资料提示，严重烧伤引起的心肌细胞自噬活动增强可能是烧伤后心肌损害与心功能降低的重要原因之一。但本实验发现的小鼠严重烫伤后心、肝、肺、肾组织细胞自噬增加是否也与各器官组织结构及功能损害有关，有待进一步研究证实。

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