女性外阴瘙痒与白念珠菌超敏反应的关系

王雪连，孔庆涛，刘 芳，沈永年，王高峰，冯 姣，党洁明，桑 红

0 引 言

外阴阴道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)为外阴瘙痒常见病因。近年来随着抗生素及糖皮质激素的广泛应用，VVC的发病率呈明显上升趋势。美国2007年资料显示，约75%的女性一生中至少患过1次VVC，40% ～50%的女性发病2次以上［1-3］。Neves等［4］对24 例复发性 VVC 患者研究发现，60%的患者曾有过敏史，其中5例对氟康唑不敏感的患者在加服西替利嗪后症状得以缓解，这些均提示VVC引起外阴瘙痒过程中除了分泌物刺激及念珠菌产生毒素的直接刺激后，还存在其他引起瘙痒的机制。临床中观察到部分VVC患者抗真菌治疗菌学转阴后，外阴瘙痒症状仍然存在。针对是否念珠菌感染病史可改变念珠菌抗原与宿主之间的相互作用，以及患者对定植于此部位的低浓度念珠菌发生超敏反应，导致外阴瘙痒久治不愈这一问题，我们通过试验研究白念珠菌超敏反应与外阴瘙痒之间的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2011-03-06至2011-05-10南京军区南京总医院门诊87例女性患者资料，年龄20～72岁，以其中33例确诊为VVC的外阴瘙痒患者作为 VVC组，年龄(31.0±7.1)岁;26例伴有VVC病史的外阴瘙痒患者作为VVC病史组，年龄(36.9±10.8)岁;28例皮炎、湿疹及特应性皮炎患者作为对照组(36.1±12.6)岁。各组患者年龄、临床资料差异均无统计学意义，具有可比性。入选标准:VVC的诊断依据中华医学会妇产科学分会感染性疾病协作组制订的诊治标准［5］;VVC病史组患者就诊时真菌学阴性;对照组患者无外阴瘙痒，阴道分泌物真菌直接镜检阴性，既往无VVC病史;皮炎、湿疹的诊断依据中国临床皮肤病学诊断标准［6］;特应性皮炎的诊断依据Williams特应性皮炎诊断标准［7］。排除标准:排除其他外生殖器感染性疾病，且无其他病理学改变证据，2周内未使用抗生素，1周内未使用阴道用药，2周内未使用糖皮质激素外用制剂，3d内未使用过抗组胺药物，1周内未使用免疫调节剂［8］。本研究经医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 白念珠菌斑贴变应原制备

1.2.1 白念珠菌培养及灭活 将已分离纯化的白念珠菌标准菌株CMCC(F)C1a(由中国医学真菌保藏中心提供)接种到含1%蛋白胨，0.1%葡萄糖的液体培养基中27℃水浴振荡培养3 d。白念珠菌悬液经以离心半径13.5 cm，2000 r/min离心沉淀收集底层白念珠菌细胞，然后将收集到的白念珠菌细胞在PBS液中冲洗3次。将冲洗过的白念珠菌细胞放入高压锅121℃，15 min高压蒸汽灭活［9］。

1.2.2 白念珠菌变应原制备 灭活白念珠菌接种到沙堡氏葡萄糖琼脂培养基37℃培养3 d，观察有无菌落生长。灭活后白念珠菌悬液以离心半径13.5 cm，2000 r/min离心沉淀收集底层细胞，放在烘箱内烘干。称取灭活细胞干重，加入凝胶中分别制成0.4%、1%、4%、20%菌悬液放于4℃冰箱中保存。对照组为不加白念珠菌细胞的凝胶剂［10］。白念珠菌点刺液由德国默克公司提供;阴性对照液为等渗盐水，阳性对照液为0.1%组胺。

1.3 方法

1.3.1 念珠菌镜检及培养 外阴消毒后将无菌等渗盐水浸湿的2根棉拭子置于阴道后穹隆处，留置30s，并尽可能多地取出阴道分泌物。一份标本用等渗盐水湿片法直接镜检，发现假菌丝及芽生孢子诊断为阳性;另一份标本，接种到含氯霉素的沙堡氏葡萄糖琼脂培养基27℃培养3 d，并分离纯化所得菌株，将纯化菌株接种到CHROMagear培养基(由上海科玛嘉微生物技术有限公司提供)进行菌种鉴定。27℃培养2 d的CHROMagear培养基上分离的显色菌落:绿色至翠绿色菌落为白念珠菌;蓝灰色菌落为热带念珠菌;紫色凸起、表面光滑湿润菌落为光滑念珠菌;粉红色至紫色、扁平、较大、表面粗糙、边缘模糊有微毛菌落为克柔念珠菌;白色至淡粉色菌落为其他念珠菌。

1.3.2 白念珠菌斑贴试验 选择受试者背部皮肤，用等渗盐水清洁，将挤满4种不同浓度念珠菌变应原及凝胶空白对照的斑贴试纸贴于受试者背部，试剂用量均以挤满测试纸的小格子为标准(斑试器由南京艾罗高生物工程有限公司提供)。贴敷后48 h除去受试物，72 h进行结果判读，参考ICDRG标准记录［8］。最后根据本研究实际观察结果进行2级统计报告:局部无红斑或仅有轻度红斑反应者为阴性;局部出现红斑、水肿性红斑并丘疹者为阳性。

1.3.3 白念珠菌SPT 选择患者前臂屈侧皮肤，等渗盐水清洁，先滴组胺阳性对照液和等渗盐水阴性对照液，后滴白念珠菌变应原，两点距离不少于2 cm，用点刺针垂直通过滴在皮肤上的渗液，轻快的刺入皮肤，使针尖下面有少量试液进入皮肤，15～20 min后观察并记录皮肤反应。阳性结果判定标准:以变应原与组胺所致风团面积比确定级别，比值＞1/4为(+);比值≥1/2为(2+);阳性对照范围相等为(3+);＞2倍阳性对照范围者为(4+)。阴性:无反应或与等渗盐水反应相同。

1.4 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。两组间率的比较采用χ2检验，必要时采用Fisher确切概率检验，行x列表数据样本率之间的两两比较采用χ2检验，采用Bonferroni法进行校正检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 白念珠菌斑贴试验结果 每位患者至少1种浓度白念珠菌斑贴阳性记为阳性反应。3组之间斑贴阳性率总体比较差异有统计学意义(χ2=9.542，P=0.008)，其中VVC组与VVC病史组比较差异无统计学意义(χ2=0.120，P=0.728);VVC 组及 VVC病史组与对照组比较差异有统计学意义(χ2=8.681，P=0.003;χ2=6.268，P=0.012)。见表 1。患者对不同浓度白念珠菌斑贴试剂阳性反应结果见表2。VVC组和VVC病史组中共有10例患者对低浓度(0.4%和1%)白念珠菌反应较高浓度白念珠菌更加明显，见图1。

表1 各组患者斑贴结果［n(%)］Table 1 Patch test results of the patients n(%)

表2 不同浓度白念珠菌斑贴阳性结果［n(%)］Table 2 Reactions to 4 different concentrations of C.albicans n(%)

图1 1例患者白念珠菌斑贴实验第3天结果Figure 1 Response to different concentrations of C.albicans allergens in one case(Day 3)

2.2 白念珠菌SPT结果 所有患者白念珠菌SPT均为阴性。

2.3 念珠菌培养结果 33例VVC患者中白念珠菌24 例(72.7%);非白念珠菌 9 例(27.3%)，其中光滑念珠菌6例，热带念珠菌3例，见图2。斑贴试验结果为白念珠菌(阳性例数14例，阳性率58.3%)与非白念珠菌(阳性例数5例，阳性率55.6%)的患者斑贴阳性率差异无统计学意义(P=1.000)。

图2 VVC患者白念珠菌在CHROMagear显色培养基的结果Figure 2 Results of CHROMagear Candida in patients with VVC

3 讨 论

本研究通过在受试者背部进行白念珠菌斑贴试验来研究白念珠菌超敏与外阴瘙痒之间的关系，尽管背部皮肤与外阴皮肤的结构不完全相同，但朗格汉斯细胞密度在皮肤与外阴黏膜部位非常接近［11］。朗格汉斯细胞通过传递穿过组织的抗原给淋巴结内T细胞，诱导超敏反应，并且外阴免疫细胞群不受激素水平影响，在整个月经周期是稳定的［12-13］。许多关于外阴瘙痒的病因学研究均会采用斑贴试验的方法，并且得到的结果多具有临床相关性［14-15］。

本研究结果提示除了感染因素、分泌物刺激、念珠菌产生的毒力因子直接毒性作用外，念珠菌引起外阴阴道的IV型超敏反应也是引起外阴瘙痒的重要原因。虽然白念珠菌蛋白为大分子物质，但本研究所用的白念珠菌抗原混合物中可能存在一些小的肽类物质可以渗透皮肤，或者大的肽类分子在皮肤表面自发降解或在一些活性酶的作用下降解为小分子物质。念珠菌细胞壁中含有能诱导宿主免疫应答的成分:主要是细胞壁中的蛋白质、甘露聚糖、甘露糖蛋白(甘露糖与蛋白质形成的共价糖蛋白)及葡聚糖［16-17］。Mencacci等［12］曾研究发现一种甘露糖蛋白片段(MP-F2)可在小鼠身上诱导IV型超敏反应，并可影响小鼠Th1和Th2免疫应答的平衡，在念珠菌特异性DTH中发挥重要作用。Marquis等［13］用热杀死的白念珠菌诱导小鼠DTH，并分别在白念珠菌悬液中分离出相对分子质量为43 000的蛋白质及相对分子质量为21 000、27 000和38 000的糖蛋白，并且这种白念珠菌悬液成功诱导了小鼠强烈的DTH。

本组中某些患者低浓度白念珠菌斑贴反应较高浓度白念珠菌明显，可能高浓度白念珠菌作为一种致病微生物可激活人体Toll样受体2信号途径，导致机体对白念珠菌的局部免疫抑制［18］。阴道分泌物培养结果为白念珠菌与非白念珠菌的感染者之间斑贴阳性率差异无统计学意义，分析原因可能是白念珠菌与非白念珠菌之间具有相同的抗原决定簇刺激产生DTH，或不同种念珠菌之间存在交叉过敏反应。

本研究中所有患者白念珠菌SPT均阴性。我们对以外阴瘙痒为主诉的VVC患者进行白念珠菌SPT未发现1例阳性反应，分析原因可能是我们使用的商品化的白念珠菌抗原中不包含所有的白念珠菌抗原决定簇。白念珠菌含有许多能引起机体免疫应答的抗原决定簇［16-17］，此外在皮肤黏膜表面的各种酶的作用下白念珠菌蛋白可分解暴露其他的抗原决定簇，但这些抗原决定簇不存在于商品化的白念珠菌抗原中。此外，Weissenbacher等［19］提出这种阴道分泌物TH2细胞因子水平升高及念珠菌特异性IgE Ab的出现提示这是一种发生于阴道局部的超敏反应，这也可能是我们在试验对象前臂进行白念珠菌SPT结果为阴性的原因。

确定引起白念珠菌斑贴阳性反应的抗原决定簇及斑贴试验最适白念珠菌浓度，进行斑贴试验时最大限度地模拟外阴微环境均是我们需要进一步研究和探讨的问题。本研究发现用自制的白念珠菌过敏原能引起外阴瘙痒患者阳性斑贴反应，并且阳性率明显高于对照组。由此我们得出结论对于念珠菌的超敏与外阴瘙痒关系密切，这也为VVC患者外阴瘙痒的治疗提供新的思路。

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