4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯通过PTEN/PI3K/Akt抑制YAC-1细胞增殖和诱导其分化

彭晓清，陈飞虎，葛金芳，汪 楠，潘春晓，雷 静

(安徽医科大学药学院，安徽合肥 230032)

全反式维甲酸 (all trans retinoic acid，ATRA)在细胞生长和分化过程中起重要调节作用，常做化疗药物和肿瘤形成抑制剂［1］。众所周知，ATRA能诱导急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)细胞逐渐向正常细胞分化从而达到治愈目的，但长期用药导致维甲酸综合征［2］和耐药［3］等不良反应。本课题组前期以ATRA为先导化合物进行了结构优化和筛选，结果表明4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯 (4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate，ATPR)可抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导其分化成熟［4，9］，并已申请自主知识产权(专利公开号:CN101591280、CN102008443A)，有望成为一种新型抗肿瘤药物。

cyclinD在淋巴瘤的发生过程中起重要作用。有研究证实在淋巴瘤细胞中抑制Akt磷酸化从而降低cyclinD过表达能抑制肿瘤细胞生长［5］。PTEN/PI3K/Akt是经典信号通路之一，在肿瘤中研究较为广泛［6］，但是在诱导分化中的研究却很少。因此本研究以鼠淋巴瘤细胞株YAC-1为研究对象，通过体外实验观察ATPR对鼠淋巴瘤细胞增殖及分化的影响，并探讨PTEN/PI3K/Akt通路和cyclinD在该过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 新型维甲酸衍生物ATPR由安徽医科大学药学院合成。纯度为99.66%，溶于无水乙醇，配置成1×10－2mol·L－1浓度(使用终浓度中乙醇含量为0.02%)，－20℃储存备用。RPMI 1640培养液为Gibco公司产品;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;瑞氏－吉姆萨染液购自南京建成生物工程研究所;LY294002和LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒购自碧云天公司;全反式维甲酸ATRA和TPA购自美国Sigma公司;NBT购自Amresco公司;逆转录试剂盒和PCR试剂盒均为Promega公司产品;PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;抗RARα抗体、抗RARβ抗体、抗PTEN抗体购自安博公司;抗RARγ抗体购自Abcam公司;抗β-actin、抗cyclinD抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司;抗Akt、抗p-Akt抗体购自Cell Signal公司;ECL化学发光剂购自Thermo公司。

1.2 细胞培养 YAC-1细胞株购自中科院细胞库，采用含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养液，并加入青霉素0.1 IU·L－1和链霉素 100 mg·L－1的培养体系培养。培养环境为37℃，5%的CO2培养箱，每2 d换液1次，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 MTT法检测细胞增殖状况 将YAC-1细胞以5×103个/孔的浓度接种于96孔培养板中，每孔为100 μl。实验分组分为空白对照组(加入RPMI 1640培养液)、溶剂对照组(0.02%无水乙醇)、ATRA 组(为阳性对照组，浓度为 10－5mol·L－1)、ATPR 组(10－5、10－6、10－7、10－8、10－9mol·L－1)，每孔的终体积为 200 μl，分别在 24、48、72 h 时加入 MTT(浓度为 5 g·L－1)20 μl，继续培养 4 h 后，离心(159 ×g，5 min)弃上清，每孔加入150 μl的 DMSO，震荡摇匀。酶联免疫检测仪测吸光度(A490)值，每组设5个复孔，重复3次，取其平均值。

1.4 LDH法检测细胞毒性 将YAC-1细胞以5×103个/孔的浓度接种于96孔培养板中，每孔为100 μl。实验分组为无细胞的培养液孔(背景空白对照孔)，未经药物处理的对照细胞孔(样品对照孔)，未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性对照孔)，以及“1.3”中的实验组别，终体积为200 μl。72 h 在样品对照空加 LDH 释放液20 μl，混匀，孵育1 h，离心(159 × g，5 min)吸取上清 120 μl转移至新的96孔板中，每孔加入LDH检测工作液60 μl，室温孵育30 min。酶联免疫检测仪测吸光度(A490)值，每组设5个复孔，重复3次，取其平均值。

1.5 细胞形态学观察 将细胞以4×105个/孔的浓度接种于6孔板中，实验分组如“1.3”，每孔终体积2 ml。作用72 h后，收集细胞离心，加PBS重悬、混匀，滴加在载玻片上，自然风干后，依次滴加瑞氏－吉姆萨染液A液和B液。流水冲洗细胞，干燥后在显微镜(400×)下观察细胞形态，并拍照。

1.6 NBT还原实验 将细胞以4×105个/孔的浓度接种于6孔板，实验分组如“1.3”，作用72 h后，收集细胞。取500 μl新鲜配置含100 mg·L－1TPA的0.1%NBT溶液，分别与等体积经不同处理后的细胞悬液混合，37℃孵育30 min后，离心去上清，沉淀涂片。每组设3个复孔，每孔观察4个视野，计数NBT阳性细胞(胞质含蓝灰色颗粒的细胞为阳性细胞)，根据以下公式计算每个复孔的NBT阳性率，比较组间差异。

1.7 半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测细胞 RARα，RARβ和 RARγ表达

1.7.1 RNA提取和 RT-PCR 将细胞以4×106个/孔的浓度接种于培养瓶中，实验分组为空白对照组(加入RPMI 1640培养液)、溶剂对照组(0.02%无水乙醇)、ATRA组(为阳性对照组，浓度为10－5mol·L－1)、ATPR 组(10－5mol·L－1)。药物作用细胞72 h后，按逆转录试剂盒结合说明书及引物反应条件进行逆转录和目的基因扩增，检测RARα、RARβ、RARγ基因的表达。各种引物序列和扩增产物长度见 Tab 1。循环条件:94℃预变性5 min;94℃变性40 s，退火 RARα (53℃)、RARβ (50℃)、RARγ (53℃)、β-actin(53℃)40 s，延伸72℃1 min。35个循环后72℃延伸10 min。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳(80 V，30 min)，用凝胶自动成像2 000扫描和分析结果，以β-actin为内参作相对定量分析。以3次实验结果做统计学分析。

Tab 1 Oligonucleotide primer sequences used for RT-PCR analysis

1.7.2 Western blot 药物作用72 h后，弃培养液，用预冷PBS洗涤3遍，每瓶加入400 μl RIPA裂解液(含10%PMSF)裂解30 min，将细胞转移到1.5 ml EP管中，离心取上清，使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。将上清与上样缓冲液按4∶1的比例进行分装，100℃煮10 min变性，－80℃保存待用。50～100 μg蛋白经12%SDS-PAGE胶分离后转移到PVDF膜上。TBST洗膜10 min。含5%脱脂奶粉(TBST溶解)封闭2h。随后加入一抗 (1∶500)4℃孵育过夜。TBST洗脱3次，每次5 min，孵育二抗1 h，TBST洗脱4次。均匀涂化学发光剂ECL于PVDF膜上，在Bioshine chemiQ4600曝光设备上曝光拍照。结果采用Image-Pro Plus图像分析管理系统分析。

1.8 Weston blot检测 PTEN、Akt、p-Akt、cyclinD的表达 设空白对照组(加入RPMI 1640培养液)、溶剂对照组(0.02%无水乙醇)、ATRA组(为阳性对照组，浓度为 10－5mol·L－1)、ATPR 组(10－5mol·L－1)、LY294002 抑 制 剂 组 (25 nmol· L－1)，LY294002(25 nmol·L－1)+ATPR 组(10－5mol·L－1)，检测 PTEN、Akt、p-Akt、cyclinD 蛋白的表达变化。实验步骤如“1.7.2”。

2 结果

2.1 ATPR对YAC-1细胞生长的抑制作用 如Tab 2所示，与空白对照组相比，溶剂对照组并无明显变化，表明无水乙醇(0.02%)作为溶剂对细胞增殖无影响，因此可排除溶剂对本实验的影响。ATPR(10－5、10－6、10－7、10－8、10－9mol·L－1)体外给药42 h和72 h对细胞产生不同程度的抑制作用，72 h抑制作用较强，并随着药物浓度升高抑制作用增强。

Tab 2 Effects of ATPR on the proliferation of YAC-1 cells detected by MTT assay(±s，n=3)

Tab 2 Effects of ATPR on the proliferation of YAC-1 cells detected by MTT assay(±s，n=3)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs solvent group

GroupConcentration/mol·L －1 A490 24 h 48 h 72 h Control 0.1483 ±0.0048 0.4800 ±0.0078 0.9240±0.0130 Solvent 0.1449 ±0.0044 0.4713 ±0.0090 0.9153 ±0.0073 ATPR 10 －5 0.1461 ±0.0043 0.3664 ±0.0073＊＊ 0.5921 ±0.0068＊＊10 －6 0.1471 ±0.0062 0.3869 ±0.0077＊＊ 0.6160 ±0.0090＊＊10 －7 0.1450 ±0.0065 0.4094 ±0.0062＊＊ 0.6737 ±0.0069＊＊10 －8 0.1490 ±0.0048 0.4521 ±0.0114* 0.7360 ±0.0064＊＊10 －9 0.1470 ±0.0043 0.4670 ±0.0071 0.8724 ±0.0084 ATRA 10 －5 0.1505 ±0.0056 0.4850 ±0.0048＊＊ 0.5768 ±0.0076＊＊

2.2 ATPR对YAC-1细胞毒性作用 如Fig 1所示，与溶剂组比较，ATPR(10－5～10－9mol·L－1)体外用药72 h后，随着药物浓度的升高，药物对细胞毒性增强，以药物浓度10－6mol·L－1细胞毒性升高最为明显(0.244±0.013)，与溶剂对照组比较(0.077±0.008)，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

2.3 ATPR对细胞形态学影响 YAC-1细胞在ATPR(10－5～10－9mol·L－1)作用72 h 后，瑞氏 －吉姆萨染色后显微镜(400×)观察显示，和空白组和溶剂对照组细胞相比，ATPR(10－5mol·L－1)细胞生长缓慢，生长疏松，细胞数量减少，核质比减少，肿瘤细胞特点有一定改善。见Fig 2。

2.4 ATPR对分化细胞阳性率的影响 如Tab 3所示，与溶剂组比较，ATPR(10－9mol·L－1)作用 72 h后对YAC-1细胞NBT阳性细胞率无影响。但随着 ATPR 剂量增加(10－5～10－9mol·L－1)，NBT 的阳性细胞率逐渐增加，并具有统计学意义(P＜0.01)，当剂量增加到 10－5mol·L－1时，其诱导分化作用与ATRA相似。提示ATPR可诱导YAC-1细胞分化。

Fig 1 Cell cytotoxicity of YAC-1 cells detected by LDH(±s，n=6)

Tab 3 Effect of ATPR on the NBT positive cell in YAC-1 cells(±s，n=3)

Tab 3 Effect of ATPR on the NBT positive cell in YAC-1 cells(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs solvent group

Group Concentration/mol·L －1Positive cell/%Control 5.00 ±2.00 Solvent 7.67 ±2.08 ATRA 10 －5 67.00 ±3.61＊＊ATPR 10 －5 65.30 ±2.52＊＊10 －6 53.00 ±4.00＊＊10 －7 38.00 ±2.00＊＊10 －8 27.67 ±3.79＊＊10－910.33 ±2.52

2.5 RARα、RARβ、RARγ mRNA 和蛋白的表达结果如Fig 3、4所示，与溶剂对照组比较，ATPR(10－5mol·L－1)作用 72 h 后，YAC-1 细胞 RARα的mRNA和蛋白表达量均明显增加，而 RARβ、RARγ的mRNA和蛋白表达量则无明显变化。

2.6 PTEN、Akt、p-Akt、cyclinD 蛋白的表达Western blot结果显示，与溶剂对照组相比，ATPR(10－5mol·L－1)作用72 h后，YAC-1细胞 PTEN 蛋白表达量增加，而cyclinD和p-Akt的蛋白表达则明显降低。PI3K抑制剂LY294002也可抑制YAC-1细胞的p-Akt和cyclinD的表达，并且LY294002作用6 h后加入ATPR(10－5mol·L－1)组p-Akt和cyclinD的表达最低。见Fig 5。

3 讨论

Fig 2 Effect of ATPR on the morphological changes of YAC-1 cells after 72 h(400×)

20世纪70年代，Sachs发现在某些抑制增殖和诱导分化的物质作用下小鼠白血病细胞系的异常分化是可逆的，因此提出了诱导分化治疗(differentiation therapy)的概念，即应用化学药物诱导肿瘤细胞分化并逆转其增殖、浸润、转移等恶性表型，使其成为正常或接近正常细胞，从而达到治疗的目的。全反式维甲酸是诱导分化治疗的代表性药物，对淋巴瘤等血液系统肿瘤有良好的治疗作用［7］，但长期应用导致的耐药性［2］及其他不良反应［8］限制了其临床应用。本课题组前期研究中以ATRA为先导化合物设计合成了维甲酸衍生物ATPR，证实其可抑制食管癌、胰腺癌、宫颈癌等肿瘤细胞增殖和诱导分化［9］，但其对淋巴瘤的治疗作用尚不明确。

Fig 3 RT-PCR analysis of YAC-1 cells retinoid acidreceptors mRNA expression after ATPR treatment(±s，n=3)

Fig 4 Effect of ATPR on protein expression of retinoid acid receptors in YAC-1 cells(±s，n=3)

Fig 5 Effect of ATPR on protein expression of PTEN，Akt，p-Akt，cyclin D in YAC-1 cells(±s，n=3)

本研究以鼠淋巴瘤YAC-1细胞为实验对象，观察了ATPR对淋巴瘤的治疗作用。结果表明，ATPR(10－5～10－9mol·L－1)体外用药 72 h 可明显抑制YAC-1细胞增殖，其中10－5mol·L－1ATPR 作用最为明显，LDH实验结果提示ATPR抑制YAC-1细胞增殖的作用可能与其细胞毒性作用相关。

细胞分化主要表现形态和功能两个方面，形态分化是细胞分化的基本特征。形态学上的分化成熟是表明恶性肿瘤细胞分化的标志［10］。经过ATPR作用72 h的YAC-1细胞在形态学上有趋向高分化状态的改变。NBT还原试验是从功能及生物化学变化方面来反映细胞分化的常用指标，且是目前公认的反映细胞分化的敏感指标之一［11－12］。本研究结果表明，ATPR(10－5～10－9mol·L－1)体外用药72 h后YAC-1细胞的NBT细胞阳性率明显升高。以上结果提示，ATPR可抑制鼠YAC-1细胞增殖并诱导其分化。

维甲酸类药物经维甲酸结合蛋白转运至细胞核内与核受体RARs或RXRs结合，激活目的基因，从而参与调控多种重要生理过程［13］。不同细胞中RARs分布不同，因此ATRA在不同细胞中可以激活不同的维甲酸受体亚基［14］。研究表明［7］，在淋巴瘤细胞中ATRA提高RARα和RXRγ介导的细胞周期阻滞和凋亡。本研究通过RT-PCR和Western blot方法观察了ATPR对维甲酸受体RARs表达的变化，结果表明ATPR可诱导RARα的表达增加，但对RARβ和RARγ的表达无明显影响，提示ATPR对YAC-1细胞的抑制增殖和诱导分化作用可能是通过和RARα结合实现。课题组前期研究结果表明ATPR对乳腺癌的抑制增殖和诱导分化作用则是通过调节 RARβ和 RARγ的平衡实现［4］。进一步证实维甲酸类药物可通过不同肿瘤细胞中的不同RARs亚基发挥其治疗作用。

肿瘤细胞中抑癌基因PTEN的缺失或表达下调可引起PIP3催化亚基的表达放大，进一步激活PI3K/Akt通路的磷酸化［15］。Dal Col等［5］在套细胞淋巴瘤中发现通过增加GSK-3促进Akt的依赖性蛋白酶降解，降低Akt的磷酸化，从而抑制cyclinD的过表达。本研究结果表明，ATPR(10－5mol·L－1)体外用药72 h后YAC-1细胞的PTEN蛋白表达量增加，而cyclinD和p-Akt的蛋白表达则明显降低。提示ATPR可能通过调节抑癌基因PTEN的表达，参与调节Akt的磷酸化和cyclinD表达发挥其抑制增殖和诱导分化作用。

综上所述，ATPR可明显抑制YAC-1细胞增殖并诱导其分化程度增高，其机制可能与结合RARα受体，继而调控PTEN/PI3K/Akt通路及cyclinD表达有关。

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