新型褪黑素受体激动剂Neu-P11激活AMPK减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤

黄 靓，王汉群，张 弛，高勇强，向 琼，王平平，尹卫东

(南华大学1.心血管疾病研究所、2.外科学总论教研室，湖南衡阳 421001)

褪黑素(melatonin，MT)是一种主要由松果体分泌的吲哚类神经内分泌激素。研究发现［1］，褪黑素对心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤具有明显的保护作用，但由于褪黑素提取困难、半衰期短、大剂量使用副作用较大等特点，临床应用价值有限。因此，新型褪黑素受体激动剂将有可能成为减轻心肌I/R损伤的新药物。Neu-P11是由本项目组与以色列Neurim Pharmaceuticals公司共同研制开发的一种高效、非选择性的MT1/MT2受体激动剂，它半衰期长，能激活褪黑素受体，从而起到类似褪黑素的作用［2］。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一种细胞内能量感受器，当细胞受到任何引起ATP生成减少与消耗增加的应激刺激时，AMP/ATP比值增加，AMPK则被激活。多项研究表明［3－4］，通过激活AMPK信号途径能够减轻心肌I/R损伤。我们曾发现Neu-P11能够激活脂肪细胞AMPK，改善3T3-L1脂肪细胞的胰岛素抵抗［5］。据此，我们推测Neu-P11还可能通过影响心肌细胞AMPK信号通路，产生相应的生物学效应。本实验利用大鼠H9c2心肌细胞系建立缺氧/复氧模型，模拟体内心肌缺血/再灌注损伤，研究Neu-P11对心肌细胞缺氧/复氧的作用及分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞株 H9c2心肌细胞株购自上海生命科学研究院细胞库。

1.2 主要试剂 Neu-P11由以色列Neurim Pharmaceuticals公司提供，AMPK抑制剂Compound C购自Sigma-Aldrich公司。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒、细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所。其它化学试剂均为国产分析纯产品。

1.3 缺氧/复氧心肌细胞损伤模型的建立 ①将H9c2心肌细胞按2×106/瓶的细胞数接种，置含15% ～20%血清的DMEM培基中常规培养3～4 d;细胞处理前24 h换用无血清的DMEM液(Glucose 45 000 mg·L－1)培养，使细胞生长同步于G0期;②实验开始前0.5 h，制备模拟缺血缺氧液;将细胞换用模拟缺血缺氧液(Glucose 10 000 mg·L－1)，再将心肌细胞和厌氧指示剂一起置于双层自封密闭袋的深处，充入低氧气体(95%N2，5%CO2)，5 L·min－1，以驱逐瓶内空气，持续30 min，同时观察厌氧指示剂，待厌氧指示剂由紫色变成粉红色(提示瓶内氧气浓度低于0.1%)后，将双层自封密闭袋封闭，维持自封袋内无氧状态2 h;③改供常氧，培养液换用含血清的DMEM(Glucose 45 000 mg·L－1)培养液中培养24 h。

1.4 实验细胞分组 实验分为5组:①常氧对照组:实验开始后不给予任何干预措施，仅以无血清的DMEM培养液与实验组同步培养，待实验完毕后与实验组同时收集标本进行检测;②缺氧/复氧组(H/R组):经历2 h缺氧后改供常氧气体24 h;③Neu-P11+H/R处理组:Neu-P11加入无血清的DMEM培养液中，浓度为 1 μmol·L－1，培养 12 h 后，换以新鲜的无血清DMEM培养液继续培养，后续处理同缺氧/复氧组。④Neu-P11+Compound C+H/R组:先用 10 μmol·L－1Compound C 处理细胞 30 min后，换新鲜无血清培养基，再加入1 μmol·L－1Neu-P11，培养12 h后，换以新鲜的无血清DMEM培养液继续培养，后续处理同缺氧/复氧组。⑤Compound C+H/R 组:先用 10 μmol·L－1Compound C处理细胞30 min后，换以新鲜的无血清DMEM培养液继续培养，后续处理同缺氧/复氧组。

1.5 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡 各实验组细胞按要求处理后，2.5 g·L－1胰蛋白酶消化贴壁的心肌细胞，1 000 r·min－1离心 10 min，去上清，PBS漂洗2次，沉淀中加入70%乙醇固定。1 000 r·min－1离心10 min，去上清，PBS漂洗2次，调整细胞浓度为1 ×109·L－1。加50 μl RNase至终浓度 1 g·L－1，37℃水浴 30 min。加 PI至终浓度 50 mg·L－1，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块，4℃避光染色30 min后，上流式细胞仪检测(激发波长:488 nm;发射波长:610 nm)各期细胞DNA的含量。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以DNA组方图出现低于G1期DNA含量的亚G1峰的大小代表凋亡细胞的多少。

1.6 LDH、CK的测定 实验终止时，取每组细胞培养液，严格按照试剂盒说明测定LDH和CK的含量。

1.7 SOD、MDA的测定 实验终止时，收集各组细胞，用4℃PBS洗涤3遍后，加入适量4℃细胞裂解液裂解细胞，4℃离心后取上清液待测。检测步骤按试剂盒说明书进行。

1.8 AMPK活性的检测 参照文献报道的方法［6－7］，选用 MBL 公司 AMPK 活性检测试剂盒(CY-1182)，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 各组细胞凋亡百分率的比较 结果如Tab 1所示，H/R组细胞凋亡百分率为(35.6±3.8)%，而H/R+Neu-P11组细胞凋亡百分率仅为(12.7±2.3)%，两组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。另外，H/R+Neu-P11+Compound C组与H/R+Neu-P11组比较，细胞凋亡率明显增加(P＜0.05)，说明加入AMPK的阻断剂Compound C，能够部分取消Neu-P11的抗细胞凋亡效应。

Tab 1 Comparison of the rate of apoptosis of each group(±s，n=10)

Tab 1 Comparison of the rate of apoptosis of each group(±s，n=10)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;+P＜0.05 vs H/R+Neu-P11

Group Apoptotic rate/%Control 4.3 ±1.2 H/R 35.6 ±3.8*H/R+Neu-P11 12.7 ±2.3#H/R+Neu-P11+Compound C 21.6 ±4.5+H/R+Compound C 48.6 ±4.2#

2.2 Neu-P11预处理对H9c2心肌细胞CK、LDH、MDA、SOD水平的影响 结果如Tab 2所示，H/R组细胞CK、LDH、MDA水平明显上升，而SOD水平明显下降，与Control组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。然而，H/R+Neu-P11组细胞较H/R组细胞CK、LDH、MDA水平明显下降，SOD水平明显升高，与H/R组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

Tab 2 Effect of Neu-P11 on CK，LDH，MDA and SOD of cultured H9C2 cardiomyocytes by A/R injury(±s，n=10)

Tab 2 Effect of Neu-P11 on CK，LDH，MDA and SOD of cultured H9C2 cardiomyocytes by A/R injury(±s，n=10)

*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs H/R;+P ＜0.05 vs H/R+Neu-P11.

Group CK/U·L－1 LDH/U·L－1 MDA/μmol·g－1Pro SOD/U·mg－1Pro Control 1386±276 715±72 2.5±1.0 65±20 H/R 2549±443* 1216±176* 7.6±2.3* 42±17*H/R+Neu-P11 1724±335# 863±115# 4.0±1.6# 61±18#H/R+Neu-P11+Compound C 2239±542+1021±148+ 6.6±1.9+ 41±20+H/R+Compound C 2716±691# 1295±158# 8.5±2.8# 46±23#

2.3 Neu-P11预处理对H9C2心肌细胞AMPK活性的影响 结果如Fig 1所示。H/R组细胞AMPK活性明显降低，与对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。Neu-P11预处理可以明显改善H/R组细胞AMPK的活性，H/R+Neu-P11组与H/R组比较，AMPK活性明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

Fig 1 Effect Neu-P11 pretreatment on AMPK activity ofH9C2 myocardial cells

近年来许多研究表明，褪黑素不仅可以抑制自由基的产生，而且能直接消除已形成的自由基及其相关反应物的活性，减轻心肌的缺血/再灌注损伤，预防短暂缺血/再灌注引起的心律失常，减少30 min缺血和2h再灌注引起的心肌梗死面积，可明显改善缺血/再灌注后心肌血流动力学［8］。其作用机制主要包括以下几个方面:直接清除自由基，防止其对组织细胞的损害;抑制脂质过氧化反应;抑制炎性反应，从而减少自由基的生成;稳定细胞膜，增加细胞膜对氧化损伤的抵抗力，在高浓度自由基环境下褪黑素可上调Ca2+通道的数量及功能状态，避免细胞内钙超载的发生;抑制线粒体通透性转换孔的开放;减少白细胞黏附与聚集。

Neu-P11是一种新型褪黑素非选择性受体激动剂，与褪黑素受体MT1/MT2具有高亲和力，能发挥类似褪黑素的作用。本实验采用体外培养的H9C2细胞建立缺氧/复氧模型，模拟体内的心肌缺血/再灌注损伤，从细胞水平对Neu-P11抗心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及作用机制进行研究。由于细胞膜通透性增高，使心肌富含有的酶，如LDH、CK等大量释放进入血液，因此血清中这些酶活性升高的程度，即可反映心肌损害的程度。实验结果显示Neu-P11可明显减少H/R后培养基中CK及LDH水平，说明Neu-P11可减轻细胞膜的损伤程度，降低细胞膜通透性，具有心肌细胞膜的稳定作用。缺血后再灌注，机体通过多种途径产生多种自由基，造成细胞膜脂质产生过氧化反应。MDA是脂质过氧化反应的主要产物，因此测定心肌内MDA含量，可反映脂质过氧化程度;体内自由基的清除依靠SOD等抗氧化酶系统，因此测定SOD活性可以间接反映机体清除氧自由基的能力。本实验结果显示，心肌细胞H/R后MDA含量明显增加，SOD活性下降，而应用Neu-P11预处理后，MDA含量明显下降，SOD活性显著增强，提示Neu-P11能够减轻脂质过氧化反应，保护线粒体结构，减轻心肌缺血/再灌注损伤。细胞凋亡是缺血/再灌注组织损伤功能丧失的重要原因，心肌缺血/再灌注时，大量氧自由基产生，细胞内钙超载及线粒体损伤等均可促进心肌细胞凋亡，造成心肌损伤。本实验中我们用流式细胞仪测定细胞凋亡率，结果显示Neu-P11可明显抑制心肌细胞凋亡，对H/R损伤心肌细胞凋亡有明显保护作用。

AMPK作为一种能量调控器，对心脏尤其是当心脏面临缺血性损伤对能量需求明显增加时具有重要作用［9］。活化的AMPK能够增加葡萄糖摄取和糖酵解，加速脂肪酸氧化增加心肌组织的能量供应，并能抑制心肌细胞凋亡来保护心肌组织［10］。本研究还显示，AMPK特异性抑制剂Compound C可部分阻断Neu-P11在H/R中抗细胞凋亡的作用。H/R+Neu-P11+Compound C组细胞凋亡率等各项指标较H/R+Neu-P11组明显恶化，AMPK磷酸化水平降低，提示Neu-P11可能通过AMPK途径在H/R中发挥其抗细胞凋亡的作用。另外，本实验结果还显示，与H/R组相比，H/R+Compound C组中各项指标变化更为明显，也证实了AMPK对H/R心肌细胞的抗凋亡作用。

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