右美托咪定预防吗啡耐受及其对脊髓内胶质细胞和ERK的影响

周 宁，陈春龙，高 珊，高献忠，刘清珍，刘 健，嵇 晴，李伟彦

(1.徐州医学院麻醉学重点实验室，江苏徐州 221002;2.南京军区南京总医院麻醉科，江苏南京 210002)

吗啡和其他阿片类镇痛药因其耐受和依赖等副作用而严重影响了其在临床上的使用。近来的研究发现，脊髓胶质细胞的活化在吗啡耐受的发生和维持中发挥重要作用［1－3］。强效、高选择性的α2受体激动剂右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)在急性炎性痛、术后痛乃至神经病理性疼痛中都具有一定的镇痛作用，且有研究发现它能明显抑制坐骨神经结扎大鼠脊髓背角星形胶质细胞的肥大和ERK信号通路的活化［4］，但其对吗啡耐受的影响尚不清楚。本研究观察预先给予右美托咪定对正常大鼠吗啡耐受的作用及其对脊髓星形胶质细胞活化和ERK磷酸化的影响，探讨右美托咪定在多模式镇痛及防治阿片耐受中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与分组 ♂ SD大鼠48只(南京军区南京总医院比较医学科提供)，体质量180～220 g，随机分成6组，每组8只。Ⅰ组空白对照组;Ⅱ组吗啡(批号:120714-2，东北制药集团沈阳第一制药有限公司)耐受组;Ⅲ组 50 μg·kg－1右美托咪定对照组;Ⅳ 组 12.5 μg· kg－1右 美 托 咪 定 (批 号:12100534，江苏恒瑞医药股份有限公司)处理组;Ⅴ组 25 μg·kg－1右美托咪定处理组;Ⅵ组 50 μg·kg－1右美托咪定处理组。

1.2 给药方案 参照Raghavendra等［2］方法建立吗啡耐受模型，即每天8∶00和17∶00皮下注射吗啡10 mg·kg－1，连续5 d;Ⅰ组和Ⅲ组皮下分别注射等量生理盐水和右美托咪定;Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组在早上注射吗啡前30 min皮下注射相应剂量的右美托咪定。

1.3 行为学测试 d 1、d 7，参照 Bianchi等［5］方法测定各组大鼠热缩足潜伏期(PWTL)。每只大鼠重复测定5次，最长照射时间为20 s以防组织损伤，删除最大和最小值，取平均值作为大鼠的基础潜伏期。测定基础PWL后，皮下注射吗啡10 mg·kg－1后30 min测定每组大鼠的PWL，取其平均值作为镇痛阈值并计算最大镇痛效应百分比(%MPE)，即%MPE=(镇痛阈值－基础潜伏期)/(最长照射时间－基础潜伏期)×100%。

1.4 标本收集 d 7，测试完各组大鼠行为学后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.4 g·kg－1，其中4只留取腰膨大用于ERK和p-ERK含量的测定。另外4只经左心室灌注4%多聚甲醛，留取腰膨大保存于4%多聚甲醛中，放于4℃冰箱保存，用于免疫组织化学检测。

1.5 免疫印迹法(Western blot) 取腰膨大，组织匀浆，以15 000 r·min－1离心5 min后取上清液，采用考马斯亮蓝法进行蛋白定量，定量后加入相应体积的Loading buffer和PBS缓冲液煮沸5 min使其变性。经SDS凝胶电泳，转至经甲醛激活的PVDF膜，室温下在5%脱脂牛奶中封闭1 h，兔抗大鼠ERK和p-ERK一抗(1∶1000，Cell Signaling Technology)4℃孵育过夜。d 2，5%脱脂牛奶洗5 min×3次，TBST洗5 min×3次，间隔洗，羊抗兔二抗(1∶1000，Cell Signaling Technology)室温孵育 1 h，5% 脱脂牛奶洗5 min×3次，TBST洗5 min×3次，间隔洗，暗室内增强型化学发光试剂(ECL)显色曝光，内参为 GAPDH(1 ∶1 000，Cell Signaling Technology)。应用UN-SCAN-IT gel软件分析免疫印迹条带。

1.6 免疫组织化学染色 取腰膨大，置于4%多聚甲醛中固定24 h，蔗糖脱水沉底，行冰冻冠状切片，厚约15μm。按标准免疫组化染色SP法进行。一抗采用多克隆兔抗大鼠GFAP(1∶500，Santa Cruz Biotechnology)，湿盒4℃孵育36～48 h，生物素标记的羊抗大鼠IgG，37℃孵育1 h，辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育1 h，DAB 显色、贴片、脱水、透明、封片。光镜下观察，摄片。

1.7 统计学分析 采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析，计量数据采用±s表示，两两组间比较采用LSD检验，组间均数比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 行为学测试 d 1，6组大鼠之间基础热痛阈和MPE值差异无统计学意义。d 7，各组大鼠在皮下注射吗啡前基础PWL无差异(Tab 1)。皮下注射10 mg·kg－1吗啡30 min后，与Ⅰ组相比，Ⅱ组和Ⅳ组大鼠的MPE值明显降低。与Ⅱ组相比，Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ组大鼠的MPE值均升高(P＜0.05)，但Ⅳ组差异比较无统计学意义(Fig 1)。

Tab 1 PWL of each group before subcutaneous injection of morphine(±s，n=8)

Tab 1 PWL of each group before subcutaneous injection of morphine(±s，n=8)

Group Basic PWL/s d 1 d 7Ⅰ9.97 ±1.54 9.94 ±1.54Ⅱ9.83 ±0.74 9.85 ±0.73Ⅲ9.22 ±0.70 9.23 ±0.70Ⅳ9.91 ±1.60 9.87 ±1.59Ⅴ10.59 ±1.03 10.56 ±1.03Ⅵ10.11 ±0.89 10.05 ±0.88

Fig 1 %MPE at 30min of rats on day 1 and day 7

2.2 ERK和p-ERK的表达 各组大鼠腰5脊髓内总ERK的表达无明显差异。与Ⅰ组相比，Ⅱ组和Ⅳ组腰5脊髓内p-ERK表达量明显升高;与Ⅱ组相比，Ⅴ、Ⅳ组腰5脊髓内p-ERK表达量明显降低(P＜0.05)(Fig 2)。

Fig 2 Expression of ERK and p-ERK in L5 spinal cord

2.3 GFAP的表达 免疫组织化学结果显示，Ⅰ组和Ⅲ组大鼠腰5脊髓背角仅有少量的GFAP表达，而Ⅱ组大鼠腰5脊髓背角GFAP表达量明显增多。与Ⅱ组相比，皮下50 μg·kg－1右美托咪定处理组即Ⅵ组大鼠腰5脊髓背角GFAP表达量明显减少(Fig 3)。

3 讨论

吗啡是一种强效的止痛剂，然而反复使用却会形成耐受状态，其确切的病理机制仍然不是很清楚。近年来脊髓胶质细胞活化在吗啡耐受发生和维持中的作用逐渐被认识。2001年Song等［1］首次报道腹腔连续注射吗啡可导致明显的吗啡耐受，同时引起大鼠脊髓、后扣带回皮层以及海马的星形胶质细胞明显肥大;鞘内给予非特异性胶质细胞抑制剂——氟枸橼酸，能明显缓解吗啡镇痛作用的耐受以及星形胶质细胞标志物角质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫活性的增强。抑制胶质细胞的活性已经被证实能减弱吗啡耐受的形成［6］。给予胶质细胞抑制剂丙戊茶碱能明显抑制胶质细胞的活性，缓解吗啡耐受［7］。此后大量的报道证明多种非特异性胶质细胞抑制剂如:己酮可可碱［8］、米诺环素［9］等能明显缓解吗啡耐受。这些研究均提示了通过调控胶质细胞，特别是星形胶质细胞的活性可以有效的预防吗啡耐受的形成和发展。

研究发现，吗啡能引起 ERK的磷酸化［10］。鞘内注射ERK抑制剂能减弱神经损伤引起的痛觉过敏［11］。大鼠鞘内连续注射吗啡7 d后脊髓星形胶质细胞中磷酸化的ERK明显增多，而抑制星形胶质细胞中ERK通路的激活能够缓解吗啡耐受［12－13］。磷酸化的ERK能激活胶质细胞，刺激炎性分子的产生和释放并放大疼痛信号［14］。Liu等［4］研究发现注射DEX能明显抑制坐骨神经结扎大鼠脊髓背角星形胶质细胞的肥大和ERK信号通路的活化。DEX腹膜内注射，从炎症早期开始，明显抑制单关节炎诱导的热痛觉过敏和脊髓胶质细胞的活化，特别是星形胶质细胞［15］。因此我们认为DEX可能具有预防吗啡耐受的作用。

由于DEX的高脂溶性，全身注射后能快速通过血脑屏障激活中枢神经系统的α2受体，所以在本实验中选择皮下注射。皮下注射更容易操作，但很明显，和鞘内给药相比会需要更大剂量。在本实验中观察到在高剂量DEX作用下，大鼠出现嗜睡现象，但24 h后对老鼠活动未见明显影响。因为DEX的半衰期大约是2 h，所以本实验中DEX的注射时间是每天7∶30，而行为学测试时间为d 7为8∶00以尽量减少DEX本身的镇静和镇痛影响。

Fig 3 Expression of GFAP in dorsal horn of spinal cord

在吗啡耐受过程中，降钙素基因相关肽(CGRP)水平升高，而阻断CGRP受体能减弱吗啡耐受的形成［13］。α2受体的活化能减少CGRP、兴奋性氨基酸的释放，它们与吗啡耐受的形成密切相关。DEX可能通过减少这些物质的释放从而抑制了星形胶质细胞的活化。和我们的结果相反，Peng等［16］的研究表明用50 nmol·L－1DEX处理体外培养的胶质细胞能增加ERK的表达，而高浓度的DEX对ERK的表达没有影响。ERK是多种刺激触发的共同信号通路，它的角色是广泛和复杂的，其活化的程度，表达的位置，ERK表达的结果会随着刺激的不同而改变［17］。胞内 Ca2+离子浓度的升高和NMDARs的活化对ERK的活化非常重要。Zheng等［18］证实 DEX能抑制脊髓内 NMDARs的活化。DEX对p-ERK抑制作用的机制仍不是很清楚，可能通过抑制NMDARs活化或激活神经元和胶质细胞膜上的α2受体从而影响胞内Ca2+浓度进而影响了p-ERK的表达从而抑制了星形胶质细胞的活化。但是具体的机制还需要进一步的研究。

综上所述，DEX能预防正常大鼠吗啡耐受的形成且与剂量有关，这可能与其有效地抑制了脊髓内ERK的磷酸化及星形胶质细胞的活化有关。本研究结果为临床上降低单一用药的剂量和不良反应，提高对药物的耐受性，加快起效时间，延长镇痛时间等提供新选择。

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