三叶青黄酮对肺癌A549细胞生长抑制与MAPKs通路关系的研究

钟良瑞，魏克民

(1.浙江中医药大学附属省立同德医院肿瘤科，浙江 杭州 310053;2.浙江省中医药研究院，浙江 杭州 310007)

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年上升，严重危害人类的健康;因此，开发安全有效的新药具有重要意义。三叶青属于葡萄科崖爬藤属植物(Tetrastigma hemsleyanumDielset)，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的作用［1］。近年来，三叶青的抗肿瘤作用备受关注;前期研究表明三叶青具有明显的抗肿瘤作用［2－3］。有研究表明［4］三叶青对肺癌A549细胞有抑制增殖和促凋亡作用，但其机制有待进一步研究。因此，本实验探讨三叶青黄酮(radix tetrastigma hemsleyani flavone，RTHF)对人肺癌 A549细胞促凋亡及其作用机制具有可行性，为三叶青进一步开发研究提供理论依据。

1 材料

1.1 细胞株 A549细胞株由浙江省医学科学院提供，浙江中医药大学细胞实验室培养传代，实验所用为生长状况良好的细胞。

1.2 药品与试剂 三叶青:购自浙江省中医药研究院，由浙江省中药新药研发重点实验室提取制备;RPMI 1640培养液:杭州吉诺生物医药技术有限公司;Hyclone胎牛血清;CCK-8:日本同仁化学研究所;Hoechst 33258染色液:碧云天生物技术研究所;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒:南京凯基生物技术有限公司;p-p38、p-ERK、p-JNK:美国CST公司。

1.3 仪器 3111型CO2细胞培养箱:美国Thermo公司;3001型酶标仪:美国Thermo公司;IX71型荧光显微镜:日本OLYMPUS公司;流式细胞仪:美国BD公司;蛋白印记检测系统:美国Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 细胞培养 细胞培养液含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，条件为37℃、含5%CO2的培养箱内。待细胞长至瓶底80%左右，用胰酶消化，传代，取对数生长期细胞用于实验。

2.2 CCK-8检测生长抑制率 取对数生长期的A549细胞，用0.25%胰酶消化，制备成5×107·L－1的细胞悬液，按每孔100 μl接种于96孔板，贴壁后更换培养液并加不同浓度三叶青黄酮(0、0.5、1、5、10 g·L－1)分5 组，每组6 复孔;分别在24、48、72 h检测，450 nm处测定各孔吸光度A值。根据公式:抑制率/%=(1－加药组A值/对照组A值)×100%，计算不同浓度三叶青黄酮对A549细胞的抑制率。

2.3 荧光显微镜观察细胞凋亡形态 A549细胞经不同浓度的三叶青黄酮(0、1、5、10 g·L－1)处理 48 h后，吸除培养液;加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗，加入Hoechst 33258避光染色5 min;PBS漂洗，荧光显微镜观察细胞核的形态。

2.4 流式细胞仪分析细胞凋亡率 取对数生长期A549细胞，以2×105个/孔细胞悬液接种于6孔板;细胞贴壁后，加不同浓度三叶青黄酮(0、1、5、10 g·L－1)。作用48 h后收集细胞，PBS洗涤，加入500 μl的结合缓冲液Bind Buffer悬浮细胞，先后加入 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI，混匀后室温避光孵育15 min，上流式细胞仪检测分析，激发波长为488 nm。

2.5 Western blot检测MAPKs通路相关蛋白的影响 冰上操作，刮下细胞，移至1.5 ml离心管。每瓶细胞加 250～500 μl RIPA 裂解液，1200 r·min－1离心 5 min，收获蛋白，测定蛋白浓度。用SDS-PAGE电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，一抗室温孵育2～3 h，二抗室温孵育1 h。室温下，ECL混合液滴加在PVDF膜上，避光反应3～5 min，放入蛋白印记检测系统的暗箱内，在暗室中，曝光、显影、定影。以β-actin作为内参进行分析。

2.6 统计学方法 用SPSS 13.0统计软件分析处理。统计描述:计量资料数据用±s表示。组间比较采用方差分析。

3 结果

3.1 三叶青黄酮对A549细胞生长抑制率 不同浓度三叶青黄酮作用于A549细胞24、48、72 h后，CCK-8检测显示三叶青黄酮对A549细胞有明显抑制作用，随浓度的增加、时间延长，抑制率逐渐增高，呈剂量、时间依赖性。见Tab 1。

Tab 1 Inhibitory ratio of RTHF at different concentrations on growth of A549(%，±s，n=6)

Tab 1 Inhibitory ratio of RTHF at different concentrations on growth of A549(%，±s，n=6)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.

－1 0.5 1 5 10 24 h 4.56±0.69 9.62 ±1.35 26.00±2.30＊＊ 55.77 ±2.30 Time RTHF concentration/g·L＊＊48 h 9.97±1.16* 24.49 ±1.91＊＊ 44.69±1.80＊＊ 67.50 ±1.60＊＊72 h 24.17±2.04＊＊ 45.34 ±1.77＊＊ 68.14±0.78＊＊ 71.57 ±0.92＊＊

3.2 三叶青黄酮对A549细胞凋亡形态的影响不同浓度三叶青黄酮作用于A549细胞48 h后，经Hoechst 33258染色结果表明:对照组细胞呈均匀蓝色荧光(Fig 1a);1 g·L－1低浓度组细胞核颜色稍亮(Fig 1b);5 g·L－1中浓度组部分细胞核呈致密浓染，颜色变亮(Fig 1c);10 g·L－1高浓度组细胞凋亡最明显，完整细胞核结构少见 (Fig 1d)。随着药物浓度增加，细胞凋亡形态逐渐明显。

3.3 流式细胞仪检测三叶青黄酮对A549细胞凋亡率 与空白对照组相比，经药物处理48 h后细胞凋亡的比例均有明显升高，且呈现一定的剂量－效应关系。差异有统计学意义(P＜0.01)。见Fig 2。

Fig 1 Microscopic images of A549 cultured with RTHF for 48h(Hoechst 33258，200 × )

Fig 2 Flow cytometric testing apoptosis of A549 cultured withRTHF at different concentrations for 48h

3.4 不同浓度三叶青黄酮对A549细胞MAPKs通路相关蛋白表达的影响 Western blot结果显示，不同浓度三叶青黄酮处理细胞后，随着药物浓度增加，p-p38、p-ERK蛋白表达明显升高，p-JNK蛋白表达无明显变化。见Fig 3。

4 讨论

Fig 3 Expression of apoptosis-related MAPKs signal pathway proteins of A549 cultured with RTHF

本实验通过CCK-8证实:三叶青黄酮对人肺癌细胞株A549的生长有明显抑制作用，且有浓度、时间依赖性，其中三叶青黄酮浓度为10 g·L－1、作用72 h时，对细胞的抑制率最高。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，通过分子水平进行调控，在肿瘤发生发展中起重要作用。本实验通过荧光显微镜观察经Hoechst 33258染色后的A549细胞出现形态学改变，凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，颜色变亮，出现增强的蓝色荧光，部分细胞核出现新月状亮蓝色荧光边集于核膜下;高浓度时几乎无完整的细胞核结构。流式分析Annexin V-FITC和PI双染，显示三叶青黄酮可诱导肺癌A549细胞凋亡，且与浓度呈正相关。诱导凋亡是多数抗肿瘤药物的主要机制，本研究证实三叶青黄酮可以明显诱导肺癌A549细胞的凋亡。

MAPK(mitogen-activated protein kinase)是丝裂原活化蛋白激酶，MAPKs信号通路是真核细胞内重要信号转导系统，调节细胞的增殖、分化、凋亡等过程［5］。包含3条并行的 MAPKs信号通路:①ERK信号转导通路(extracellular signal regulated protein kinases)即Ras-to-MAPK通路，包括ERKl和ERK2，是MAPKs系统经典通路;②JNK/SAPK信号转导通路;③p38-MAPK通路。

ERK是被克隆并鉴别最早的MAPK家族成员［6］，ERK级联反应主要作用于细胞的增殖分化，在癌症中常被激活。有研究发现［7］ERK通路在肺腺癌形成早期阶段已被激活。JNK又被称为应激活化蛋白激酶(SAPK)，JNK信号传导途径在细胞应激反应中起重要作用［8］。研究发现［9］JNK 途径在肺癌细胞的生长和凋亡方面起着重要作用。p38蛋白激酶为38 ku酪氨酸磷酸化蛋白激酶，p38通路既可影响肺癌的发生发展［10］，又可作为评估肺癌预后指标，p38表达阳性的患者预后较差。Mu等［11］研究发现二氢青蒿素诱导肺癌PC-14细胞凋亡的作用与激活p38通路相关。本实验通过Western blot检测结果显示与对照组相比，随三叶青黄酮浓度增加，pp38和p-ERK蛋白表达水平升高，p-JNK表达无明显变化，提示三叶青黄酮可能通过激活p38MAPK途径和ERK途径诱导A549细胞凋亡。

综上所述，三叶青黄酮对肺癌A549细胞具有抑制增殖和促进凋亡作用，通过增加p-p38和p-ERK蛋白表达，激活p38MAPK途径和ERK途径可能是其凋亡机制之一。

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