甘草总黄酮抑制慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜腺体萎缩及机制研究

郑 君，林晓春，陈育尧，白殊同，佟 丽

(南方医科大学中医药学院，广东广州 510515)

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic costritis，CAG)是一种由多种因素引发的、以胃黏膜腺体萎缩为特征的临床常见消化系统疾病，发病率占全部慢性胃炎的10%～20%。研究表明CAG具有2.55%～7.46%的癌变率，世界卫生组织(WHO)已将慢性萎缩性胃炎定义为癌前状态［1－2］。因此，对慢性萎缩性胃炎的积极治疗，阻断向胃癌发展具有重要的临床意义。迄今为止，现代医学对CAG尚无特异性治疗药物，临床上常采用促上皮细胞生长和促胃肠蠕动药物以根除幽门螺杆菌感染;补充铁和维生素B12等方法治疗CAG，但均无法从根本上逆转胃黏膜的萎缩及由此引发的胃功能损伤。中医药在治疗难治性疾病上以其独特治疗方法取得明显的临床疗效，中医将CAG归为胃脘痛、呃逆、痞满等范畴，以益气健脾、活血化瘀、疏肝理气、清热解毒药物治疗取得较好的临床效果。因此，从临床治疗CAG有效中药及天然药物中寻找和发现有效的活性成分，是研制抗CAG药物的有效途径之一。

甘草为豆科类植物甘草(Glycyrrhiza uralensisFisch)的根及根状茎，具有补脾益气、清热解毒、缓急止痛等功效，其活性成分甘草总黄酮具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、镇痛等多种作用［3］。我们前期研究证明甘草总黄酮对慢性浅表性胃炎大鼠胃黏膜损伤有明显的保护和修复作用［4］;同时，抑制浅表性胃炎大鼠血清促炎因子的释放，有明显抗炎镇痛作用［5］。甘草总黄酮对慢性萎缩性胃炎是否也有保护和修复作用尚未见报道。本研究采用萎缩性胃炎大鼠模型，评价甘草总黄酮对CAG大鼠胃黏膜损伤的保护和修复作用，并研究其相关作用机制。

1 材料

1.1 动物 SD(Sprague-Dawley)大鼠，体质量(200±20)g，SPF级，♂♀各半，6周龄，实验动物质量合格证号0095570，实验设施合格证号0051356，由南方医科大学实验动物中心提供。

1.2 药物与试剂 甘草总黄酮，购自惠州市九惠制药股份有限公司(101110);维酶素片，北海阳光药业有限公司(101120);大鼠胃泌素(GAS)试剂盒，Bio-swamp公司(201110);胃蛋白酶测试盒，南京建成生物工程研究所(20120224);牛胆汁提取去氧胆酸钠(进口分装)，美国Amresco公司(0613);水合氯醛，天津市科密欧化学试剂开发中心(20040220);大鼠白介素-1 beta(IL-1β)试剂盒，Dakewe公司(E3012-1203-1);大鼠白介素-6(IL-6)试剂盒，Biolegend公司(B150707);PBS缓冲液试剂包，博士德生物工程有限公司(AR0030)。

1.3 实验仪器 iMARK酶标仪，美国Bio-Rad公司;752N紫外分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司;BA 110S万分之一电子天平，Sartorius公司;YP10002电子称，上海佑科仪器仪表有限公司;EG 1160组织病理包埋仪，RM 2135组织病理切片机，德国Leica公司;HC3018R高速冷冻离心机，安徽中科科学仪器有限公司;TDL-40B低速离心机，上海安亭科学仪器厂;ECLIPSE Ti-S电子显微镜，日本Nikon公司;BH-2光学显微镜，日本Olympus公司。

2 方法

2.1 大鼠慢性萎缩性胃炎模型制备、分组及给药［6－7］SPF级SD大鼠，适应性饲养7 d后，剔除不合格动物，随机分为正常对照组、模型组。模型组大鼠自由饮用20 mmol·L－1去氧胆酸钠溶液(去离子水配制，pH 7～7.8)1个月，每隔10 d灌服1次60%乙醇2 ml/只;从d 30起分别给予30%乙醇及10 mmol·L－1去氧胆酸钠溶液自由饮用，每7 d轮换1次，在造模后d 80、d 100随机抽取模型组大鼠，进行胃组织病理学检测，判定模型复制情况。造模100 d后，将模型动物随机分为模型对照组、维酶素组、甘草总黄酮高(0.60 g·kg－1)、低(0.15 g·kg－1)剂量组，并与正常对照组同时纳入实验，每组12只。

2.2 胃黏膜组织病理学检查［8］胃组织10%甲醛溶液固定，取胃组织进行常规石蜡包埋，切片，HE染色，以慢性炎症程度(单核细胞浸润)、炎症活动性程度(中性粒细胞浸润)以及萎缩性程度(黏膜固有层固有腺体的减少)作为评分指标，每项分为正常(－)、轻度(+)、中度(■)、重度(■)(对应 0、1、2、3分，有其余炎性表现加1分)，最终以幽门部和胃体部两者得分和为病理学炎性评分结果，正常:0分;轻度:1～4分;中度:5～8分;重度:9分以上。2.3 胃液分泌量及胃蛋白酶活性测定 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉后仰位姿势，垫高头部使其高于胃位置，幽门下0.3 cm处结扎。5 h后，剪开结扎处10 ml离心管收集5 h胃液，4 000 r·min－1，15 min 后，吸取上清液测量体积并转入 2.0 ml EP 管，13 000 r·min－1，10 min，取上清按试剂盒说明书测定胃蛋白酶活性。

2.4 血清中GAS、IL-1β、IL-6含量测定 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉后，腹主动脉采血，3 500 r·min－1离心 15 min，按试剂盒说明书操作方法测定血清GAS、IL-1β、IL-6含量。

2.5 统计学分析 应用SPSS 13.0进行数据统计学分析，数据以±s表示，计量资料采用单因素方差分析;组间比较采用两独立样本t检验。

3 结果

3.1 胃黏膜层组织病理学变化 正常对照组胃黏膜腺管排列整齐，大小形状一致，呈单柱状，壁细胞、主细胞界限清楚，固有层内胃腺体排列紧密整齐，未见或少见炎性细胞，黏膜下层无水肿(Fig 1A)。模型组胃黏膜充血、水肿、腺管排列紊乱或疏密不均且黏液层脱落增多、胃小凹变浅，同时黏膜固有层变薄，黏膜肌层紊乱、增厚，呈束状增生渗入黏膜固有层，腺体腔变小及数目减少，并有囊性扩张，黏膜下层水肿明显，炎性细胞散在分布，固有层内有淋巴细胞浸润，有少量嗜酸性粒细胞和中性粒细胞，胃黏膜下层扩张合并下缘缺损，炎细胞多见且向黏膜固有层迁移(Fig 1B)。甘草总黄酮给药30 d后，胃黏膜固有层固有层炎性细胞数目减少，固有胃腺数目增多，腺管排列稍平整(Fig 1D，E)。与模型组比较，甘草总黄酮高、低剂量组明显抑制胃黏膜腺体萎缩;另外高、低剂量组等级分布下降，胃组织病理学检查评分明显减少(Fig 1、Tab 1、Fig 2)

Fig 1 Histopathology of the gastric mucosa in different groups(HE staining ×100)

Tab 1 Mucosal atrophy rat of the rats in different groups(n=12，%)

3.2 各组大鼠胃液分泌量以及胃蛋白酶活性分析

实验结果表明，与正常对照组比较，模型组胃液分泌量以及胃蛋白酶活性明显降低(P＜0.01);甘草总黄酮给药30 d后，甘草总黄酮高、低剂量组与模型对照组比较胃液分泌量及胃蛋白酶活性明显升高(P＜0.05，Fig 3，4)

Fig 2 Histopathology scores in different groups

Fig 3 Effect of different treatment on Gastric juice secretion in rats

Fig 4 Effect of different treatment on the activity of pepsin in rats

3.3 对血清中GAS、IL-1β、IL-6含量的影响 与正常对照组比较，模型组血清GAS、IL-1β、IL-6含量明显上升。甘草总黄酮高、低剂量组给药30 d后，血清GAS、IL-1β、IL-6水平与模型组比较明显降低(Fig 5)

4 讨论

Fig 5 Effect of different treatment on serumGAS，IL-1β，IL-6 lever in rats

慢性萎缩性胃炎是一种由多种原因引起的，以胃黏膜萎缩为主要病理表现的胃黏膜慢性炎症性病变［9］。本研究采用多因素复合方法，成功复制了大鼠慢性萎缩性胃炎模型，甘草总黄酮给药30 d后，高、低剂量组胃黏膜萎缩率明显下降，炎性细胞数目明显减少，提示甘草总黄酮对胃黏膜上皮细胞具有较好的修复作用。

大量研究显示，胃黏膜层存在多种分泌腺体，这些分泌腺体所分泌的胃液对胃起着非常重要的保护作用。慢性萎缩性胃炎患者由于胃黏膜腺体发生不同程度的萎缩，因此其胃液分泌量明显减少，胃液酸性减弱，对胃蛋白酶活性的保持作用也受到影响，使胃蛋白酶活性明显下降，而胃蛋白酶是胃液中的主要消化酶，其活性与胃液的酸性直接相关［10］。胃泌素是一种由胃以及十二指肠G细胞分泌的多肽类激素，胃液中胃泌素的主要功能是促进胃酸分泌，同时还对胃肠道黏膜具有营养和保护作用，从而能够加快胃肠道黏膜的生长和更新速度，在慢性萎缩性胃炎中由于胃黏膜上皮细胞的萎缩，导致G细胞数量的下降，从而使GAS分泌减少，GAS的减少使胃黏膜失去了激素的营养作用，又使胃黏膜进一步的萎缩，形成恶性循环［11－12］。本研究结果显示，慢性萎缩性胃炎模型对照组胃液分泌量、胃蛋白酶活性以及血清GAS含量较空白对照明显降低，说明胃液以及GAS分泌不足，胃蛋白酶活性降低，从而导致的胃液低酸状态与胃黏膜萎缩直接相关。经甘草总黄酮治疗30 d后，其高、低剂量组能够明显促进胃液以及GAS的分泌，增加胃蛋白酶活性，改善胃黏膜的营养作用，加快胃黏膜上皮细胞的更新速度，从而促进胃黏膜的修复。

促炎因子IL-1β、IL-6的分泌在慢性萎缩性胃炎的发生发展中起着重要的作用。IL-1β作为一种炎性活性细胞素，其通过刺激多种免疫和炎症细胞，促进其他炎症因子的释放，从而增强炎症反应［13］。同时IL-1β也是目前最强的胃酸分泌抑制因子，相关研究证明，IL-1β的高表达能够抑制胃酸的分泌，持续的低胃酸分泌能够使胃黏膜萎缩，甚至发生肠化生和异型增生。IL-6是胃黏膜炎症反应的重要介质，广泛参与炎症反应，其可以诱导以中性粒细胞为主的炎症细胞的聚集，造成粒细胞呼吸爆发，形成活性氧，造成组织炎症，同时这些活化的中性粒细胞又能分泌IL-1β、IL-6等细胞因子。IL-6还能通过促进一氧化氮合酶的表达，产生超氧负离子和一氧化氮，参与胃黏膜的炎症反应［14－17］。本研究结果显示，模型对照组IL-1β、IL-6较正常对照组明显升高，而甘草总黄酮高、低剂量组均能够明显下调IL-1β、IL-6水平，提示甘草总黄酮通过降低IL-1β、IL-6分泌水平，改善胃黏膜的炎症反应程度。

综上所述，甘草总黄酮对于慢性萎缩性胃炎的治疗作用可能是通过调节胃液、胃蛋白酶活性、血清GAS、IL-1β以及IL-6的水平，改善胃黏膜的炎症反应以及增加胃黏膜的防御机能，促进胃黏膜上皮细胞的更新和修复，进而对慢性萎缩性胃炎进行修复。

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