吗啡急性戒断大鼠边缘前皮层无线遥测脑电活动的研究

李 晶，潘群皖，白家明，朱再满，周鸿铭，虞 冉

(皖南医学院1.生理学教研室、2.医学影像与检验学院、3.形态实验中心，安徽芜湖 241002)

阿片类药物依赖是一种以中枢神经系统可塑性改变为基础、以复吸和强迫性用药为特征的心理和身体依赖性的慢性脑病［1］。目前，国内外对阿片依赖患者的脱毒治疗已积累了丰富的经验，但戒断后心瘾和复吸两大难题，迄今仍悬而未决。新近研究表明［2］，内侧前额皮层 (medial prefrontal cortex，mPFC)参与药物依赖有关的认知、行为、情绪调控以及学习和记忆过程。mPFC主要包括背侧部的边缘前皮层［3］(prelimbic cortex，PrL)和腹侧部的边缘下皮层(infralimbic cortex，IL)。PrL的功能改变可能在药物依赖和复吸中起重要作用［2］，Bossert等［4］研究发现，激活PrL可增强大鼠自给药环境与海洛因奖赏结合诱导的觅药行为。本研究采用脑立体定位电极埋藏及无线遥测脑电技术结合条件性位置偏爱(conditioned place preference，CPP)视频系统，实时记录分析吗啡依赖大鼠急性戒断期PrL脑电活动的特征性变化(鲜见报道)。试图从原始脑电中获取吗啡依赖大鼠CPP发生改变的行为学信息，进而阐明特征性脑电与觅药行为之间的内在联系，为从皮层功能层面研究阿片依赖机制、探索无创性治疗药物成瘾和复吸疾患，提供新的靶点和思路。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级SD大鼠30只，♀♂不限，体质量280～320 g，由苏州爱尔麦特科技有限公司提供〔许可证号:SCXK(苏)2009－0001〕。将大鼠随机分为2组，即吗啡实验组和生理盐水(NS)对照组。

1.2 药品、仪器 盐酸吗啡注射液，批号:110508－2(沈阳第一制药)。JLBehv-CPP位置偏爱视频分析系统(上海吉量);江湾2型脑立体定位仪(第二军医大学);BW-200生理无线遥测系统(成都泰盟)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠脑立体定位电极埋藏手术 1%戊巴比妥钠(5 ml·kg－1)腹腔麻醉大鼠后，将其俯卧固定于脑立体定位仪上，参照脑立体定位图谱［5］确定左右侧PrL位置:前囟前3 mm，矢状缝旁开0.6 mm，定位靶点后，实施颅骨打孔术，将漆包镍铬丝制成的记录电极插入硬膜下3.6 mm，参考电极置于头皮下，使用牙科水泥固定，封闭切口。术后皮下注射(sc)青霉素400 kU·kg－1，连续3 d，预防感染。

1.3.2 建立吗啡依赖大鼠CPP模型 封闭CPP箱通道，进行CPP训练。采用倾向性偏倚给药法，将非偏爱箱白箱作为伴药箱。实验组sc吗啡和NS［6，7］，每日各 1 次，连续 8 d，注射吗啡后置于白箱45 min，注射NS后置于黑箱45 min。吗啡剂量:d 1:10 mg·kg－1;d 2:20 mg·kg－1;d 3:30 mg·kg－1;d 4:40 mg·kg－1;d 5:50 mg·kg－1;d 6 ～8:60 mg·kg－1。对照组同法sc等量NS。

1.3.3 大鼠CPP行为测试 于建模前后对各组大鼠进行CPP测试。开放通道，任大鼠在黑白箱自由穿梭和停留15 min，记录其白箱累计停留时间。建模前对大鼠CPP测试连续3 d，每日1次，计算白箱平均累计停留时间;建模后(戒断d 1、d 3)，同法进行CPP测试。通过组间及自身给药前后比较，确定大鼠CPP的产生。

1.3.4 大鼠PrL脑电活动的无线遥测及分析 在CPP视频系统的黑白箱内(可监控大鼠行为状态)，通过脑电无线遥测系统实时记录各组大鼠不同行为状态下(黑箱停留、白箱停留、黑－白箱穿梭、白－黑箱穿梭)，左右侧PrL脑电活动。对原始脑电，采用快速傅里叶变换功能进行处理分析。采样率500 Hz，高通滤波频率 0.1 Hz，低通滤波频率 100 Hz。

2 结果

2.1 CPP行为测试结果 Tab 1测试结果显示，建模前各组大鼠白箱停留时间差异无显著性(P＞0.05)。戒断d 1、d 3，与建模前及同时段对照组相比，实验组大鼠白箱停留时间明显延长(P＜0.01)，尤其戒断d 3白箱停留时间更长，提示该时段实验组大鼠CPP行为和觅药渴求表现更强烈。对照组大鼠建模前后无明显变化(P＞0.05)。组间及组内比较结果表明，吗啡诱导CPP训练使大鼠对白箱产生CPP，建模成功。

Tab 1 Comparison of residence time of rats in white box(s，±s，n=15)

Tab 1 Comparison of residence time of rats in white box(s，±s，n=15)

＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs before modeling

Control group Experimental group Before modeling 103.5 ± s 36.3 99.7 ± s 47.5 Withdrawal d 1 98.6 ±s 40.4 153.6 ±s 46.6＊＊##Withdrawal d 3 101.2 ± s 48.7 264.8 ± s 82.8＊＊##

2.2 PrL脑电分析结果

2.2.1 黑白箱停留时PrL脑电分析 Tab 2分析结果表明，戒断d 3当大鼠在黑白箱内停留时，与对照组比较，实验组大鼠左右侧PrL脑电活动呈现:β波明显增加(P＜0.05，P＜0.01)，主要为β2波增加;δ波明显减少(P＜0.05，P＜0.01);α波及θ波无明显变化(P＞0.05)。同组大鼠在黑箱或白箱停留时，左右侧PrL脑电比较差异无显著性(P＞0.05)。

2.2.2 黑白箱之间穿梭时PrL脑电分析 戒断d 3当大鼠由黑箱向白箱穿梭时，相比对照组，实验组大鼠左右侧PrL脑电活动出现:β波明显增加(P＜0.01)，以 β2波增加明显(P＜0.01)，β1波差异无显著性(P＞0.05);δ波明显减少(P＜0.05，P＜0.01)。当实验组大鼠由白箱向黑箱穿梭时，β波明显减少(P＜0.01)，包括β1波、β2波均明显减少，δ波明显增加(P＜0.01)。在上述穿梭状态下，α波及θ波变化组间比较差异均无显著性(P＞0.05)。同组大鼠经黑－白箱穿梭或白－黑箱穿梭时，左右侧PrL脑电比较无明显差异(P＞0.05)。见Tab 3。

3 讨论

mPFC参与中枢阿片奖赏效应，有研究认为，mPFC至伏隔核(NAs)和中脑腹侧背盖(VTA)的运动输出通路，与VTA至mPFC的投射通路，构成环路，共同调节阿片药物中枢奖赏效应［8］。PrL是mPFC中与阿片成瘾密切相关的重要脑区，主要参与成瘾动机过程的调节［9］，PrL参与的神经环路增强觅药行为的重现，选择性PrL神经兴奋性损伤可减少可卡因诱导的位置偏爱现象的恢复［10］，由此提示药物成瘾后PrL的功能改变与觅药行为密切相关。

皮层脑电活动包含着丰富的生理和心理信息，药物成瘾期脑电的变化可以反映相关的认知活动［11］。觅药动机作为一种认知活动，在联络皮层形成(本课题组通过前期研究，已将觅药动机形成的范围锁定在mPFC)，整合、编码在皮层生物电序列之中，当觅药动机发作时，引起相应皮层的生物电变化，最终诱发觅药行为。在本研究中，将mPFC的PrL作为目标脑区，研究吗啡依赖大鼠觅药动机发作时PrL的脑电变化，进一步探讨该脑电改变与觅药行为之间的内在联系，以确定诱发大鼠觅药行为的特征性脑电，有助于从源头上及早干预觅药动机及行为。

Tab 2Analysis of electrical activity in PrL of rats staying in black or white box on withdrawal d 3(%，±s，n=15)

Tab 2Analysis of electrical activity in PrL of rats staying in black or white box on withdrawal d 3(%，±s，n=15)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group

Left PrL Control group Experimental group Right PrL Control group Experimental group in black box in white box δ 23.2 ±6.3 23.6 ±5.7 17.8 ±3.1＊＊ 18.6 ±3.4＊＊ 21.9 ±7.6 24.5 ±7.8 18.3 ±3.5＊＊ 20.5 ±4.5 in black box in white box in black box in white box in black box in white box*θ 23.6 ±4.2 24.2 ±4.3 23.1 ±2.6 22.9 ±3.2 21.3 ±5.4 23.2 ±3.7 22.6 ±2.9 22.5 ±3.6 α 16.5 ±2.6 16.6 ±2.7 16.9 ±2.4 17.1 ±2.6 18.2 ±3.5 16.8 ±2.4 17.0 ±2.8 16.8 ±3.4 β 36.8 ±5.4 35.6 ±5.5 41.8 ±3.0＊＊ 41.3 ±3.6＊＊ 38.8 ±8.6 35.5 ±7.3 42.3 ±3.9* 40.2 ±5.3＊＊α1 10.9 ±2.0 11.3 ±2.7 11.3 ±2.0 11.3 ±2.3 11.7 ±2.6 11.0 ±2.2 11.3 ±1.6 11.4 ±3.3 α2 5.7 ±1.4 5.4 ±1.2 5.8 ±1.2 5.7 ±1.2 6.1 ±2.0 5.8 ±1.2 5.5 ±1.1 5.4 ±1.2 β1 12.5 ±2.4 10.9 ±2.3 12.8 ±1.6 12.7 ±1.9＊＊ 13.2 ±3.2 12.1 ±2.6 13.1 ±2.2 13.1 ±1.9 β2 24.3 ±4.2 24.6 ±4.3 29.0 ±2.8＊＊ 28.6 ±2.9＊＊ 25.2 ±6.1 23.3 ±5.9 29.0 ±2.6＊＊ 27.1 ±4.4＊＊

Tab 3Analysis of electrical activity in PrL of rats shuttling between black and white box on withdrawal d 3(%，±s，n=5)

Tab 3Analysis of electrical activity in PrL of rats shuttling between black and white box on withdrawal d 3(%，±s，n=5)

black-white:rats shuttling from black to white box;white-black:rats shuttling from white to black box.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group

Left PrL Control group Experimental group Right PrL Control group Experimental group black-white white-black δ 28.6 ±7.8 17.7 ±4.3 24.0 ±6.1* 33.2 ±7.9＊＊ 28.6 ±9.2 22.6 ±4.3 21.2 ±4.4＊＊ 34.0 ±8.6 black-white white-black black-white white-black black-white white-black＊＊θ 20.2 ±3.1 19.8 ±5.9 19.1 ±5.4 20.6 ±3.1 21.7 ±5.4 20.2 ±5.5 19.7 ±3.9 20.2 ±2.9 α 17.7 ±4.8 18.8 ±3.1 17.4 ±5.3 16.8 ±4.3 16.7 ±3.4 17.9 ±3.6 16.8 ±2.8 15.7 ±3.5 β 33.2 ±5.6 43.7 ±8.1 38.7 ±6.8＊＊ 30.0 ±5.7＊＊ 33.2 ±8.3 39.4 ±7.0 42.5 ±4.0＊＊ 29.6 ±6.3＊＊α1 11.5 ±2.5 12.6 ±2.8 10.4 ±4.3 10.7 ±3.3 11.3 ±1.8 12.2 ±3.0 11.1 ±2.7 10.7 ±3.3 α2 5.4 ±1.5 6.2 ±2.0 5.7 ±1.7 5.5 ±1.6 5.6 ±2.1 5.5 ±1.5 5.8 ±1.3 5.2 ±1.0 β1 12.0 ±2.6 14.8 ±4.5 13.0 ±3.9 9.9 ±3.3＊＊ 10.8 ±2.8 14.2 ±3.1 12.9 ±2.3 9.8 ±2.2＊＊β2 21.4 ±4.6 28.9 ±6.5 25.8 ±5.3＊＊ 20.2 ±3.5＊＊ 22.4 ±6.8 25.1 ±4.8 29.1 ±3.0＊＊ 19.9 ±5.5*

本实验发现:①吗啡急性戒断大鼠在黑白箱内停留及黑－白箱穿梭时，PrL脑电快波(β波)增加，慢波(δ波)减少;在白－黑箱穿梭时，PrL脑电出现相反的改变，即快波(β波)减少，慢波(δ波)增加。分析PrL脑电活动发生特异性改变的原因，可能与成瘾相关中枢神经环路的突触可塑性有关。有文献报道［12－13］，长期使用成瘾性药物可以使mPFC的突触结构与功能发生可塑性变化，影响突触传递效能短暂或持续性的改变，如长时程增强(long-term potentiation，LTP)与长时程抑制(long-term depression，LTD)，这种突触传递效能的改变，通过某种特殊神经活动模式，引起皮层相应部位生物电活动的变化。因此mPFC参与的神经环路突触结构和功能的可塑性改变可能是吗啡依赖大鼠PrL脑电发生特异性变化的主要原因。②另有研究显示［14］，阿片药物可以使大鼠中脑网状结构对丘脑－皮层神经环路的激励增加，抑制丘脑－皮层环路的自身振荡，从而导致皮层产生去同步化的高频快波，这一理论支持本实验的结果。在急性戒断期，当吗啡依赖大鼠由黑箱向白箱穿梭时，白箱(伴药箱)作为药物相关环境线索一旦暴露，大鼠觅药动机引燃，促进PrL神经环路兴奋的输入，使中脑网状结构激励增加，PrL脑电出现去同步化改变(β波增加，δ波减少)，诱发觅药行为表达。当吗啡依赖大鼠由白箱向黑箱穿梭时，黑箱作为非伴药箱，可阻扰大鼠觅药动机及PrL神经环路的兴奋输入，使中脑网状结构激励下降，丘脑－皮层环路自发振荡增强，PrL脑电呈现同步化趋势(β波减少，δ波增加)。③同组大鼠在同一行为状态下，左右侧PrL脑电变化趋势一致，且差异无显著性，表明吗啡对左右侧PrL脑电的影响程度相同，在吗啡引起的PrL脑电改变中不存在优势半球。

综上实验结果提示:吗啡依赖大鼠觅药行为的产生伴随着PrL脑电的特异性改变，该脑电改变可能与大鼠觅药动机形成有关。

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