解毒通络方中三七皂苷类成分脑脊液药代动力学研究

李 磊，张丽慧，李 智，周晓耘，辛文锋，张文生

(1.北京师范大学地表过程与资源生态国家重点实验室北京 100875;2.北京中医药大学北京 100029;3.北京师范大学校医院北京 100875;4.中药资源保护与利用北京市重点实验室北京 100875)

三七皂苷类成分是中药三七的主要有效成分，现代药理学研究发现三七皂苷在心脑血管系统、神经系统、血液系统、物质代谢以及抗炎、抗肿瘤等方面均有较好活性［1］，三七皂苷所具有的这些功效使其在治疗脑源性疾病方面具有广阔的应用前景。解毒通络方是王永炎院士的临床经验方，由栀子有效部位、三七总皂苷以及灯盏花有效部位组成，具有祛瘀、清热、解毒的功效，主要用于治疗缺血性中风病。本文以人参皂苷Rg1及三七皂苷R1为指标成分，采用HPLC-MS/MS法测定静脉注射给药后人参皂苷Rg1及三七皂苷R1在大鼠脑脊液的动力学变化规律，同时研究解毒通络方(Jiedutongluo prescription，JDTL)复方配伍对人参皂苷Rg1及三七皂苷R1在大鼠脑脊液中分布的影响。

1 材料

1.1 药品与试剂 三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1对照品(中国药品生物制品检定所，批号分别为:110745-200415、110703-200726);三七总皂苷、解毒通络方(北京师范大学中药资源与资源药物研究所提供);甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)。1.2 仪器 Q-TRAP 3200质谱仪(Analyst 1.4.2数据处理软件，美国Applied Biosystem公司);Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。

1.3 动物 Wistar大鼠，♂，体质量(220±20)g，清洁级，购自中国医学科学院协和动物研究所。许可证号 SCXK(京)2005－0013。实验前禁食过夜，饮水不限。

2 方法

2.1 给药与采样 取大鼠6只，随机分成三七总皂苷给药组和解毒通络方给药组，每组3只。腹腔注射6 ml·kg－1(10 g·L－1)的戊巴比妥钠麻醉大鼠，剪开大鼠头颈部背侧皮肤，钝性剥离覆盖在枕骨上的肌肉，将连有PE管的针头刺入枕骨大孔，使脑脊液能顺着PE管流出。用胶黏剂以及牙科水泥固定针头并用夹子夹住PE管尾端。采集样品时取下夹子，用微量注射器缓慢抽取，采样完毕后，再用夹子夹住 PE 管末端［2］。

根据解毒通络方的处方量，按三七总皂苷(PNS)16.8 mg·kg－1(其中三七皂苷 R1的含量为8.4%，人参皂苷 Rg1的含量为21.8%)、解毒通络方(JDTL)22.2 mg·kg－1的剂量尾静脉注射分别给予三七总皂苷生理盐水溶液和解毒通络方生理盐水溶液，于给药后不同时间点(5、10、20、40、60、90、120、180、240、480 min)采集脑脊液 20 μl，置于－80℃冰箱保存备用。

2.2 脑脊液样品预处理 取脑脊液样品15 μl，加入甲醇 45 μl，涡旋振荡 1 min，离心 10 min(10 000 r·min－1)后取上清液，进样。

2.3 分析方法 液相色谱条件:色谱柱:Symmetry ShieldTMRP18(5 μm，4.6 mm ×150 mm);流动相:A为甲醇，B为水，梯度洗脱程序见Tab 1;流速:1.0 ml·min－1;进样量:20 μl;柱温:25℃ 。

质谱条件:扫描方式:多重反应监测(MRM);离子源:离子喷雾离子化源;离子喷射电压:5500 V;检测方式:正离子方式，人参皂苷 Rg1［M+Na］+(823.5/643.6)，解簇电压130 V，碰撞能量50 eV;三七皂苷 R1［M+Na］+(955.3/203.2)，解簇电压140 V，碰撞能量66 eV。

Tab 1 Gradient program of determination of notoginsenoside R1 and ginsenoside Rg1in rat cerebrospinal fluid by HPLC-MS

2.4 质控样品的制备 取空白脑脊液，加入三七皂苷R1和人参皂苷 Rg1的对照品溶液，配制成低、中、高3个浓度的脑脊液样品(三七皂苷 R1的浓度为25，100，400 μg·L－1;人参皂苷 Rg1的浓度为50，200，800 μg·L－1)，按照“2.2”方法操作后进样。

2.5 标准曲线绘制 精密称取三七皂苷 R1和人参皂苷Rg1对照品适量，置25 ml量瓶中，用甲醇配制成一定浓度的混合对照品储备液，临用时，用空白脑脊液稀释至标准系列浓度的对照品混合溶液，三七皂苷 R1的浓度分别为 2.5、5、12.5、25、62.5、125、250、500 μg·L－1，人参皂苷 Rg1的浓度分别为5、10、25、50、125、250、500、1 000 μg· L－1。按“2.2”方法操作并进样测定，以各对照品色谱峰峰面积 Y为纵坐标，对照品浓度X(μg·L－1)为横坐标，采用加权(权重1/X2)最小二乘法进行线性回归。

2.6 含药脑脊液样品测定 三七总皂苷单独给药组和解毒通络方给药组的大鼠脑脊液样品的处理方法同“2.2”。样品测定方法同“2.3”。

2.7 数据处理 实验数据用DAS 2.0版药动学软件拟合计算各项药动学参数。

3 结果

3.1 方法专属性 在采用的色谱和质谱条件下，三七皂苷R1和人参皂苷 Rg1的全扫描质谱图见Fig 1，样品测定结果见Fig 2、3。三七皂苷 R1和人参皂苷Rg1分离良好，脑脊液中的内源性物质不干扰三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的测定。

Fig 1 Full-scan mass of notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1

Fig 2 MRM of notoginsenoside R1in rat CSF determination by HPLC-MS

3.2 标准曲线与线性范围 三七皂苷R1的标准曲线:=153X+157(r=0.998 1，n=8)，线性范围为2.5 ～500 μg·L－1;人参皂苷 Rg1的标准曲线:=477X+454(r=0.993 4，n=8)，线性范围为 5～1 000 μg·L－1。三七皂苷 R1和人参皂苷 Rg1最低定量限分别为 2.5、5 μg·L－1。

3.3 精密度试验 取低、中、高3个浓度的质量控制样品，按“2.2”方法操作，进样测定，每个浓度样品连续进样3次，计算样品浓度，测定日内精密度。每个浓度的样品连续3 d，每天进样，测定日间精密度。测定结果三七皂苷R1和人参皂苷 Rg1的日内精密度RSD均小于5%、日间精密度RSD均小于12.2%，见 Tab 2。

3.4 回收率实验 取低、中、高3个浓度的质控样品进行测定，每个浓度平行操作3份，用标准曲线求得实际浓度，与理论浓度相比得到方法回收率。三七皂苷R1和人参皂苷 Rg1的平均回收率分别为98.0% ～102.7%、93.9% ～101.1%，见Tab 3。

Fig 3 MRM of ginsenoside Rg1in rat CSF determination by HPLC-MS

Tab 2 Precision of notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1in rat CSF(±s，n=3)

Tab 2 Precision of notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1in rat CSF(±s，n=3)

RSD/%Notoginsenoside R1Added/μg·L －1 Intra-day precision Determined/μg·L －1RSD/%Intra-day precision Determined/μg·L－1 25 25.7 ±0.9 3.5 24.0 ±2.0 8.3 100 101.0 ±2.6 2.6 99.1 ±12.1 12.2 400 392.0 ±14.5 3.7 380.0 ±29.6 7.8 Ginsenoside Rg1 50 50.8 ±0.6 1.2 47.8 ±3.8 7.9 200 200.0 ±5.4 2.7 216.0 ±14.9 6.9 800 751.0 ±36.0 4.8 768.0 ±73.0 9.5

Tab 3 Recovery of notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1in rat CSF(±s，n=3)

Tab 3 Recovery of notoginsenoside R1and ginsenoside Rg1in rat CSF(±s，n=3)

Added/μg·L －1Recovery/% RSD/%Notoginsenoside R1 Recovery Determined/μg·L －1 25 25.7 ±1.7 102.7 ±6.9 6.7 100 98.2 ±6.5 98.2 ±6.5 6.6 400 391.8 ±31.6 98.0 ±7.9 8.1 Ginsenoside Rg1 50 50.6 ±3.2 101.1 ±6.4 6.3 200 190.7 ±6.5 95.3 ±3.3 3.5 800 751.6 ±39.6 93.9 ±5.0 5.3

3.5 实验组脑脊液样品中三七皂苷 R1和人参皂苷Rg1的药代动力学 大鼠尾静脉注射三七总皂苷以及解毒通络方溶液后，三七皂苷 R1和人参皂苷Rg1在脑脊液中的分布浓度数据见Tab 4、5。脑脊液分布浓度－时间曲线见Fig 4、5。药代动力学参数见 Tab 6、7。

4 讨论

本实验中脑脊液样本的处理非常简单，方法回收率较高，而且Q-TRAP 3200型仪器稳定性良好，所以选择外标法进行定量。

Fig 4 Concentration-time curves of notoginsenoside R1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Fig 5 Concentration-time curves of ginsenoside Rg1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Tab 4 Mean concentration of notoginsenoside R1 in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Tab 4 Mean concentration of notoginsenoside R1 in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Time/min PNS/μg·L －1 JDTL/μg·L －1 109.4 ±82.2 97.9 ±86.8 10 188.6 ±166.8 196.0 ±139.4 20 161.2 ±82.0 275.3 ±168.4 40 250.9 ±179.0 319.3 ±216.9 60 195.5 ±160.6 265.2 ±191.8 90 149.7 ±115.5 232.1 ±204.9 120 91.6 ±76.2 133.4 ±89.5 180 67.5 ±48.6 87.8 ±39.6 240 30.2 ±15.8 53.0 ±38.7 5 480 10.2 ±4.0 9.7 ±3.7

Tab 5 Mean concentration of ginsenoside Rg1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Tab 5 Mean concentration of ginsenoside Rg1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Time/min PNS/μg·L －1 JDTL/μg·L －1 266.3 ±227.4 294.7 ±262.9 10 407.1 ±389.5 526.1 ±418.9 20 367.3 ±212.6 606.3 ±402.1 40 547.0 ±376.7 673.3 ±465.2 60 387.9 ±329.1 553.3 ±434.2 90 286.8 ±231.8 449.0 ±422.0 120 258.3 ±97.2 225.8 ±200.6 180 147.3 ±63.6 107.3 ±80.8 240 88.0 ±47.9 40.8 ±28.0 5 480 15.4 ±7.1 12.6 ±5.1

Tab 6 Pharmacokinetic parameters of notoginsenoside R1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Tab 6 Pharmacokinetic parameters of notoginsenoside R1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Parameters PNS JDTL Tmax/h 0.56 ±0.19 0.83 ±0.60 Cmax/μg·L－1 258.17 ±166.83 344.00 ±195.85 AUC0－t/μg·h·L －1 545.13 ±374.02 774.20 ±301.22 AUC0－∞ /μg·h·L－1 586.21 ±358.57 804.47 ±306.20 T 12/h 2.38 ±1.10 1.64 ±0.11 Ke/h －1 0.33 ±0.12 0.42 ±0.03 CL/L·h－1·kg－14.16 ±3.68 2.03 ±0.79

Tab 7 Pharmacokinetic parameters of ginsenoside Rg1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Tab 7 Pharmacokinetic parameters of ginsenoside Rg1in rat CSF after intravenous administration of PNS and JDTL(±s，n=3)

Parameters PNS JDTL Tmax/h 0.94 ±0.95 0.56 ±0.39 Cmax/μg·L－1 610.67 ±273.96 708.00 ±467.12 AUC0－t/μg·h·L －1 1 244.25 ±443.60 1 325.28 ±918.26 AUC0－∞ /μg·h·L－1 1 400.57 ±423.68 1 355.66 ±917.74 T 12/h 1.49 ±0.07 1.72 ±0.49 Ke/h －1 0.47 ±0.02 0.42 ±0.11 CL/L·h－1·kg－13.19 ±1.02 4.62 ±4.29

目前关于三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的血浆浓度测定已有文献报道，尚未见文献报道其在脑脊液中的分析测试方法。本实验采用HPLC-MS/MS法，建立脑脊液样品中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的定量分析方法，并研究其在脑脊液中的动态变化过程。实验结果表明，大鼠尾静脉注射三七总皂苷以及解毒通络方5～10 min后，即可在脑脊液中检测到三七皂苷R1和人参皂苷Rg1，说明两种成分都可以较快进入大鼠脑脊液中，而且消除速度也较快，8 h后的脑脊液中的浓度已相对较低。

中药在脑源性疾病治疗方面具有较好的疗效，这与中药复方配伍或有效组分配伍应用发挥了多途径、多靶点的作用有关。中药配伍应用对损伤的血脑屏障结构有改善和重建作用，还可通过影响转运体而特异性地影响血脑屏障，从而增加药物的脑内浓度，这可能就是阐明中药治疗脑源性疾病作用途径和作用机制的关键环节［3］。因此，从脑脊液药代动力学角度研究中药有效组分在透过血脑屏障时的协同配伍作用也成为一个新的研究方向，相关研究内容已有文献报道［4］。从本实验尾静脉注射三七总皂苷和解毒通络方后三七皂苷 R1和人参皂苷Rg1的药代动力学参数来看，与三七总皂苷相比，解毒通络方中三七皂苷R1和人参皂苷 Rg1的药动学参数有一定的波动，但变化不大，说明解毒通络方复方配伍对于三七皂苷R1和人参皂苷 Rg1在脑脊液中的累积没有明显的影响，推测其可能是通过其他途径发挥配伍作用。

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