通气量对灵芝菌丝体液态深层发酵合成灵芝三萜的影响

冯 杰，冯 娜，杨 焱，刘 方，贾 薇，张劲松

国家食用菌工程技术研究中心农业部南方食用菌资源利用重点实验室上海市农业遗传育种重点实验室 上海市农业科学院食用菌研究所，上海 201403

灵芝(Ganoderma lucidum)是担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、灵芝菌属真菌，是中国传统的药用真菌，具有悠久的药用历史。灵芝的关键药效成分是灵芝多糖和灵芝三萜［1］。灵芝三萜具有消炎止痛、镇静、解毒、保肝、抗艾滋病病毒、抗肿瘤、保肝作用，抑制组胺释放、血管紧张素转化酶等功能，是灵芝发挥药效的重要物质基础［2，3］。

作为灵芝类的主要化学成分之一，灵芝三萜类化合物吸引了越来越多研究者的关注。现阶段获取灵芝三萜材料的方法有3 种，一是野外子实体或人工栽培的子实体，二是灵芝孢子，三是液体发酵菌丝体和发酵液。与人工栽培灵芝相比，通过液体深层发酵技术生产灵芝三萜具有菌丝增殖速度快，不受季节影响、生产周期短、三萜类含量相对稳定等特点，现成为获取灵芝三萜的最有效方法［4，5］。尽管经过几十年来的努力，液体发酵灵芝生产灵芝三萜已取得不少成果，但是到目前为止，灵芝三萜的产量仍然不能满足其应用的需求。

近年来，灵芝液态深层发酵合成灵芝三萜的产量受到广泛的关注，由于它们所具有的各种生理活性物质，目前更多的研究集中在其药理应用［3］。很多研究集中在灵芝菌丝体摇瓶发酵的影响因素，如培养基配方优化、培养条件的选择等方面［4，6，7］。但是灵芝菌丝体液态深层发酵的扩大培养目前还很少有报道。上海交通大学钟建江等［4，7］对真菌灵芝发酵生产灵芝多糖和菌丝体中灵芝三萜酸作了较为深入的研究，涉及发酵培养基组成、环境因素的优化，发酵动力学研究及流加发酵，两段法静置培养等方面。他们在研究中发现，高的体积溶氧传质系数对菌球形态有较大影响，或使培养物中大的菌球数目增多，或使菌球直径相对增加，从而引发“氧限制”现象，而这却有利于单位细胞灵芝酸的大量合成。因此选取发酵过程中的溶氧关键点加以控制或改变，可能会显著改变原有发酵结果。

在扩大培养中影响灵芝三萜合成的因素很多，其中通气量等影响较为显著［5］。由于灵芝菌丝体在培养过程中粘度很大，对氧需求也很大［8-10］。因此为了满足在培养过程中菌球能紧密生长，提高传质系数，有必要对考虑灵芝液态深层发酵过程中的操作条件进行研究。基于以上分析，本研究采用5 L 搅拌式发酵罐研究灵芝菌丝体液态深层发酵合成灵芝三萜的扩大培养条件，考察了4 种条件下的通气量对灵芝菌丝体生长、灵芝三萜合成、还原糖消耗、以及铵根离子消耗的影响。以期得出较佳的操作条件，为灵芝菌丝体的工业放大生产提供一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 菌株

供试菌株沪农灵芝1 号由中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心上海食用菌分中心提供，菌株编号:Ganoderma lucidum G0119。

1.2 培养基

斜面培养基(g/L):去皮马铃薯200 g，加1000 mL 蒸馏水煮沸后，过滤，加入葡萄糖20 g，琼脂25 g，补加蒸馏水至1000 mL，121 ℃灭菌25 min 后备用。

种子培养基(g/L):去皮马铃薯200 g，加1000 mL 蒸馏水煮沸后，过滤，加入20 g 葡萄糖，补加蒸馏水至1000 mL，搅拌均匀，121 ℃灭菌25 min 后备用。

发酵培养基(g/L):葡萄糖30，氯化铵3.5，七水硫酸镁2，磷酸二氢钾2，调节pH 至5.50，121 ℃灭菌25 min 后备用。发酵培养基中葡萄糖，七水硫酸镁和磷酸二氢钾组成由前期研究获得，请见参考文献［11］。其中氯化铵浓度根据优化结果确定其浓度为3.5 g/L。

1.3 主要设备

发酵罐:上海保兴生物设备工程有限公司BIOTECH-5BGZ-50JS 5 L 发酵罐。

酶标仪:美国Bio-Tek 公司BioTek-Synergy HT多功能酶标仪。

1.4 培养条件

菌种活化:挑取冷冻管保藏菌种于斜面培养基中，26 ℃恒温箱倒置培养15 d 后置于4 ℃冰箱待用和保藏。

种子培养:将已活化的斜面菌种接种于装有100 mL 液体种子培养液的250 mL 三角瓶中，在150 rpm，26 ℃条件下摇床培养10 d，制得种子液。

发酵罐培养:将制备好的种子液转接至5 L 发酵罐中进行培养。其中，接种量10%，发酵罐装液量4 L，搅拌转速100 rpm，培养温度26 ℃［11］，通气量分别4，6，8，10 L/min，培养至还原糖和铵根离子浓度无明显变化结束发酵。

1.5 分析方法

菌体浓度的测定:取发酵液100 mL 在10000 rpm 下离心10 min 弃上清液，后取沉淀用去离子水洗涤3 次，收集后放在60 ℃的烘箱中烘干至恒重，精确称重。

还原糖含量的测定:取适当稀释倍数的发酵上清液，采用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖浓度［12］。

铵根离子含量的测定:取适当稀释倍数的发酵上清液，采用水杨酸钠-次氯酸钠比色法测定氯化铵中铵根离子浓度［13］。

灵芝三萜含量的测定:齐墩果酸比色法［14］。

1.6 动力学参数的计算

不同通气量条件下菌丝体比生长速率，还原糖和铵根离子比消耗速率，灵芝三萜比合成速率根据参考文献［15］计算得出。用Origin 8.5 软件对实验数据进行插值计算并求解出不同通气量条件下的比速率值。

1.7 数据处理

试验数据采用Origin 8.5 软件和SPSS 20.0 数据处理软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 通气量对灵芝液态深层发酵过程中菌丝体生长的影响

通气量对灵芝菌丝体生长、产物合成及代谢的影响是多方面的，不仅可以改变菌丝体对溶解氧摄取的环境，而且会影响菌丝体代谢过程中各种关键酶的活性。通气量对菌丝体液态发酵的影响是各种因素综合表现的结果，因此在菌丝体液态发酵过程中必须保证稳定而合适的溶氧环境，即稳定和合适的通气量。

如图1 所示的在不同通气量条件下，灵芝菌丝体的生长变化情况。由图1 分析可知，从4 L/min通气量到10 L/min，灵芝菌丝体干重呈现规律性变化。在4 L/min 和6 L/min 通气量条件下，菌丝体生长的迟滞期约在0 h 到100 h 之间，在100 h 后进入对数期，在200 h 前后进入稳定期，达到最大菌丝体含量。而在8 L/min 和10 L/min 条件下，菌丝体的迟滞期相对较短，在48 h 前后即进入对数期，约在100 h 前后进入稳定期。在8 L/min 通气量条件下，最大菌丝体干重为8.77 g/L，比4L/min、6 L/min 和10 L/min 通气量条件下分别提高44.48%、34.51%和15.09%。

再如图1 所示在不同通气量条件下，灵芝菌丝体的比生长速率也呈现规律性变化。比生长速率是指每小时单位质量的菌丝体所增加的菌丝体量称为菌丝体比生长速率。它是表征微生物生长速率的一个参数，也是发酵动力学中的一个重要参数。比生长速率值越大，表明菌丝体的生长活力越大。在4 L/min 至10 L/min 通气量范围内，在8 L/min 条件下菌丝体最早达到最大比生长速率，依次分别为10 L/min，4 L/min 和6 L/min 条件。分析原因可能是灵芝菌丝体作为好氧真菌的典型代表，其生长过程与溶解氧浓度密不可分，在适当范围内，溶解氧浓度越大，即通气量越大，越有利于菌丝体的生长。且较高的溶解氧浓度促使菌丝体的生长代谢加快，较早进入对数生长期，其比生长速率也是较早达到最大值。

图1 不同通气量下菌丝体生长和比生长速率的变化情况Fig.1 Time curves of mycelial growth and specific mycelial growth rate under different aeration rates

2.2 通气量对灵芝液态深层发酵过程中还原糖含量的影响

不同通气量对菌丝体消耗还原糖有较大差别的影响。由图2 分析可知，随着菌丝体的快速生长，还原糖的消耗也逐渐加快，通气量越大消耗还原糖的速率也越快，这与菌丝体的生长趋势是保持一致的。在8 L/min 条件下，还原糖消耗速率最快，还原糖的最终浓度为7.5 g/L，利用率为74.98%，相比较于其他条件下的利用率分别提高了56.24%、46.28%和23.92%。通气量加大，发酵液中还原糖消耗的更为彻底，与灵芝菌丝体的增加相对应。

不同通气量条件下还原糖的比消耗速率变化也很明显。比消耗速率指的是单位时间内单位菌体消耗基质的量。比消耗速率反应的是菌丝体对底物利用快慢的物理量。由图2 分析可知，在较为适中的通气量8 L/min 的条件下，发酵液中还原糖的比消耗速率最大，与之对应的比生长速率也最快。在不同通气量条件下最大还原糖比消耗速率分别为0.0679 1/h、0.0714 1/h、0.562 1/h 和0.176 1/h。在8 L/min 条件下，还原糖比消耗速率也较早达到最大值，对于菌丝体生长和灵芝三萜的合成是有利的。同时，在8 L/min 条件下，发酵后期发酵液中的溶氧仍然保持较高的浓度，因此在较大的通气量下， 灵芝菌丝体生长较为充分。

图2 不同通气量下还原糖含量和还原糖比消耗速率的变化情况Fig.2 Time curves of reducing sugar consumption and specific reducing sugar consumption rate under different aeration rates

2.3 通气量对灵芝液态深层发酵过程中铵根离子含量的影响

由图3 可见，发酵液中初始氯化铵的理论浓度为3.5 g/L，即铵根离子理论浓度为1.18 g/L。进入对数生长期的灵芝菌丝体迅速分解氮源，吸收营养物质，致使铵根离子浓度迅速下降，在4 L/min 和6 L/min 通气量条件下，发酵至240 h 铵根离子浓度保持稳定，直至发酵结束整个体系中铵根离子含量始终保持在较高的水平。在8 L/min 和10 L/min通气量条件下，发酵至156 h 铵根离子浓度保持稳定，直至发酵结束整个体系中铵根离子含量始终保持在较低的水平，尤其在8 L/min 通气量条件下，最终铵根离子的含量达到0.22 g/L，为所有条件下最低。

再由图3 分析可知，随着菌丝体的快速生长，铵根离子的消耗也逐渐加快，通气量越大消耗铵根离子的速率也越快，这与菌丝体的生长趋势是保持一致的。在较为适中的通气量8 L/min 的条件下，发酵液中铵根离子的比消耗速率最大，与之对应的比生长速率也最快。在不同通气量条件下最大铵根离子比消耗速率分别为0.00293 1/h、0.00390 1/h、0.0171 1/h 和0.00185 1/h。在8 L/min 条件下，铵根离子比消耗速率也较早达到最大值，对于菌丝体生长和灵芝三萜的合成也是有利的。

图3 不同通气量下铵根离子含量和铵根离子比消耗速率的变化情况Fig.3 Time curves of ammonium consumption and specific ammonium consumption rate under different aeration rates

2.4 通气量对灵芝液态深层发酵过程中灵芝三萜合成的影响

由图1 和图4 可见，液态深层发酵过程中灵芝三萜的积累与菌丝体的生长属于部分生长偶联型。在菌丝体处于对数生长期时，灵芝三萜合成速率较慢;当菌丝体生长进入稳定期时，菌丝体干重的增长趋势减慢，菌丝体浓度保持在一个较稳定的水平，而灵芝三萜的合成速率却有明显的提高。由图4 可知，通气量在4 L/min 至10 L/min 之间，随着通气量的提高灵芝三萜得率也在不断增加，通气量为8 L/min 时，灵芝三萜得率最大，达到2.33 mg/100 mg菌丝体，比4 L/min、6 L/min 和10 L/min 通气量条件下的灵芝三萜得率分别提高了1.39 倍、0.99 倍和0.84 倍，达到最大比合成速率0.0256 1/h 时，所用的时间最短，为70 h。由此可见，高通气量对于菌丝体生长和灵芝三萜的合成都有明显的促进作用。

再由图4 可以得出，通气量在4 L/min 至10 L/min 之间，达到最大比合成速率的时间分别为118、81、70、108 h，当通气量为8 L/min 时，比合成速率的增幅最大，且达到最大比合成速率的时间最短，而合成灵芝三萜的时间相对其他通气量条件也是最短的。综合比较灵芝三萜得率、比合成速率以及发酵周期情况，通气量在4 L/min 至10 L/min 内，8 L/min 为最佳通气量。

图4 不同通气量下灵芝三萜合成和比合成速率的变化情况Fig.4 Time curves of triterpenes production and specific triterpenes production rate under different aeration rates

2.5 通气量条件下各动力学参数变化的比较

将图1、图2、图3 和图4 中实验数据进行整理，得到不同通气量条件下灵芝菌丝体液态深层发酵过程参数，如表1 所示。在整个发酵过程中，通气量对不同参数的影响是有差异的，甚至是相反的。其中，菌丝体平均比生长速率和灵芝三萜平均比合成速率在8 L/min 条件下达到最大值，分别为18.75 ×10-31/h 和7.02 ×10-31/h，而最大菌丝体干重，灵芝三萜得率，菌丝体生产强度和灵芝三萜生产强度也是在同一条件下达到最高值。由此可见，菌丝体生长和灵芝三萜的合成是同步的。因此，在菌丝体液态深层发酵过程中在适当的通气量范围内，高的通气量利于菌丝体的生长和灵芝三萜的合成。

表1 不同通气量条件下的灵芝菌丝体发酵参数比较Table 1 Fermentation parameters in different agitation rates

注:生产强度定义为单位时间单位体积的菌丝体或灵芝三萜的生产量，单位g/(L·h)。Note:Productivity was defined as the producing amount per one litre and one hour，the unit was g/(L·h).

3 结论

在灵芝菌丝体培养过程中，溶氧浓度是一个非常关键的控制参数，氧的适度供给是保证菌丝体良好生长和代谢产物高产的必要条件，特别是对丝状真菌发酵的影响尤为明显，其中通气量对发酵液的溶氧浓度起到直接的作用。

通气量在灵芝菌丝体发酵过程中主要起着混合和调节溶氧的作用，影响着菌丝球的大小，包括影响菌丝缠绕成球或打碎菌丝球，发酵过程中通气量作用对菌丝球尺寸的影响，间接地影响菌球内氧及底物的消耗，同时对灵芝三萜的合成都有直接的影响，但是由于灵芝菌丝体对通气量敏感，过高或过低的通气量使菌丝体量、菌体形态以及灵芝三萜的合成发生一定的变化。

本实验通过考察通气量对灵芝菌丝体液态发酵过程中合成灵芝三萜的影响，研究发现，通气量在4 L/min 至10 L/min 之间，8 L/min 为最优通气量。在此条件下，灵芝三萜的生产强度最大，达到0.00131 g/(L·h)，灵芝三萜得率最大，达到0.204 g/L，菌丝体的最大菌浓达到8.77 g/L，实现了液态深层发酵灵芝三萜的高产量、高产率和高生产强度的统一。同时菌丝体对碳源(葡萄糖)和氮源(氯化铵)的利用率也最高，分别为74.97%和78.22%，对底物较高的利用率促进了菌丝体生长和灵芝三萜的合成。过高或者过低的通气量对菌丝体的生长，对底物的利用和对灵芝三萜的合成均不利。通过研究通气量对灵芝菌丝体液态发酵过程中合成灵芝三萜的影响，确定出较佳的通气量条件，可以为后续的研究提供基础，同时为生产的扩大化提供更好的参考。

1 Zhao JD (赵继鼎).The New Ganoderma lucidum of China(中国灵芝新编).Beijing:Science Publishing House，1989.51-53.

2 Chen AW.Potential benefits of ling zhi or reishi mushroom Ganoderma lucidum (W.Curt.:Fr.)P.Karst.(Aphyllophoromycetideae)to breast cancer patients.Int J Med Mushrooms，2007，9:29-38.

3 Min BS，Gao JJ，Nakamura N，et al.Triterpenes from the spores of Ganoderma lucidum and their cytotoxicity against Meth-A and LLC tumor cells.Chem Pharm Bull，2000，48:1026-1033.

4 Tang YJ，Zhang W，Zhong JJ.Performance analyses of a pHshift and DOT-shift integrated fed-batch fermentation process for the production of ganoderic acid and ganoderma polysaccharides by medicinal mushroom Ganoderma lucidum.Bioresour Technol，2009，100:1852-1859.

5 Liu GQ，Wang XL，Han WJ，et al.Improving fermentation production of individual key triterpene，ganoderic acid Me by medicinal fungus Ganoderma lucidum in submerged culture.Molecules，2012，17:12575-12586.

6 Liang S，Ren A，Mu DS，et al.Current progress in the study on biosynthesis and regulation of ganoderic acids.Appl Microbiol Biotechnol，2010，88:1243-1251.

7 Xu JW，Xu YN，Zhong JJ.Production of individual ganoderic acids and expression of biosynthetic genes in liquid static and shaking cultures of Ganoderma lucidum.Appl Microbiol Biotechnol，2010，85:941-948.

8 Ren A，Li XB，Miao ZG，et al.Transcript and metabolite alterations increase ganoderic acid content in Ganoderma lucidum using acetic acid as an inducer.Biotechnol Lett，2014，36:2529-2536.

9 Zhong JJ，Xu YN，Tan GY，et al.Signal transduction engineering:a powerful platform technology for enhancing secondary metabolite production.New Biotechnol，2014，31:S23-S24.

10 Shi L，Ren A，Mu DS，et al.Current progress in the study on biosynthesis and regulation of ganoderic acids.Appl Microbiol Biotechnol，2010，88:1243-1251.

11 Feng J，Zhang JS，Jia W，et al.An unstructured kinetic model for the improvement of triterpenes production by Ganoderma lucidum G0119 based on nitrogen source effect.Biotechnol Bioprocess Eng，2014，19:727-732.

12 He L，Xu YQ，Zhang XH.Medium factor optimization andfermentation kinetics for phenazine-1-carboxylic acid production by Pseudomonas sp.M18G.Biotechnol Bioeng，2008，100:250-259.

13 Zhang JC (张佳程)，Luo CX (骆承庠)，Zhang LJ (张丽娟).Study on salicylate-hypochlorite colorimetric determination of total Kjeldahl nitrogen.Sci Agric Sin (中国农业科学)，1999，32:85-88.

14 Tsujikura Y，Higuchi T，Miyamoto Y，et al.Manufacture of ganoderic acid by fermentation of Ganoderma lucidum.Jpn Kokai Tokkyo Koho JP 04304890，1992.

15 Ji XJ，He H，Jun D，et al.Enhanced 2，3-butanediol production by Klebsiella oxytoca using a two-stage agitation speed control strategy.Bioresour Technol，2009，100:3410-3414.