HPLC 法同时测定黄山贡菊和七月菊中的4 种化学成分

姜文青， 张亚中，* ， 金 斌

(1. 安徽中医药大学，安徽 合肥230038;2. 安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥230051)

菊花是菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat 的干燥头状花序，主治风热感冒、温病初起、肝阳眩晕、实肝风证、目赤昏花、疮痈肿毒等症状，而且疗效理想。现代研究表明，菊花含有黄酮类、酚酸类以及挥发性成分等活性物质，有着多种生理功能［1-5］。其中，黄山贡菊Dendranthema morifolium (Ramat)Tzvel. cv. Gongju 生长于海拔较高的山地，受当地独特气候及良好环境的影响，其外观、形态和品质均与生长于平原的菊花有所区别，而七月菊Dendranthema morifolium (Ramat)Tzvel. cv. Qiyueju 又称“早贡菊”，是黄山贡菊的人工培植品。近年来，关于黄山贡菊的研究多集中在化学成分分析、含有量测定以及指纹图谱考察上，但鲜有对其质量标准的报道［6-9］。本实验首次建立了同时测定黄山贡菊和七月菊中绿原酸、木犀草素、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸这四种活性成分含有量的方法，为其质量标准的建立提供了依据。

1 仪器、试剂与药品

LC-20AD HPLC 色谱仪 (日本岛津公司);AG135 电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo 公司);Agilent 8453 紫外可见分光光度计(美国Agilent 公司);KQ2200DB 数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

绿原酸 (批号110753-200413)、木犀草苷(批号111720-200604)、木犀草素(批号111520-200504)、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸(批号111782-201204)对照品(中国药品生物制品检定所)。甲酸和乙腈均为色谱纯(美国Waters 公司)。

所有样品均采自安徽省黄山市歙县，其中七月菊(QYJ1 ～QYJ12)均来自陈村镇;黄山贡菊(GJ13 ～GJ33)来自大谷运村、金竹岭村及西坡村，均由安徽省食品药品检验研究院张亚中博士鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［10-12］Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm);流动相为乙腈(A)-0.5%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱，顺序见表1;体积流量1.0 mL/min;柱温30 ℃;检测波长348 nm;进样量10 μL。结果发现，在上述条件下，各组分得到良好分离，与相邻组分峰的分离度均大于1.5，理论塔板数不低于3 000，见图1。

表1 梯度洗脱顺序Tab.1 Sequence of gradient elution

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸8.19 mg、木犀草苷7.76 mg、木犀草素7.93 mg、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸8.67 mg，置于10 mL 棕色量瓶中，70%甲醇溶解后定容，摇匀，即得。

图1 三种样品的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of three samples

2.3 供试品溶液的制备 分别精密称取黄山贡菊和七月菊粉末(过2 号筛)约0.25 g，置于50 mL圆底烧瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，加热回流提取30 min，放冷，70%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。

2.4 线性关系考察 分别精密量取一定体积的对照品溶液，置于50 mL 量瓶中，70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品贮备液。然后，分别精密吸取1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列质量浓度的混合对照品溶液。接着，分别精密吸取10 uL，在“2.1”项色谱条件下分析测定，以峰面积积分值为纵坐标 (Y)，对照品溶液的质量浓度(mg/L)为横坐标(X)，计算标准曲线回归方程，结果见表2。

2.5 精密度试验 分别精密吸取同质量浓度的混合对照品溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下重复进样6 次，记录峰面积RSD。结果，绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素的RSD 值分别为0.4%、0.4%、0.5%、0.8%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 精密称取菊花粉末6 份，每份约0.25 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样10 μL 分析测定，记录峰面积RSD。结果，绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素的 RSD 值分别为0.9%、0.3%、0.3%、1.3%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 精密吸取“2.3”项下供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、8、12、24 h，在“2.1”项色谱条件下进行测定，记录峰面积RSD。结果，绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素的RSD 值分别为0.6%、1.5%、0.2%、0.7%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

表2 4 种化学成分的回归方程、相关系数和线性范围Tab.2 Regression equations，correlation coefficients and linearity ranges of four chemical constituents

2.8 加样回收率试验 精密称取同一批号菊花(GJ-20)6 份，每份约0.125 g，再分别精密加入绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素的对照品贮备液0.54、0.68、1.36、0.01 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进行测定，计算回收率。结果，绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素的平均回收率 (n = 6)分别为99.0%、98.1%、100.1%、100.2%，RSD 分别为2.2%、1.3%、1.9%、1.5%，表明该方法回收率良好，见表3。

2.9 样品测定 按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样10 μL，在“2.1”项色谱条件下测定，计算各样品中4 种成分的含有量、平均值以及RSD值，见表4，其含有量的趋势见图2 和图3。结果显示，黄山贡菊中木犀草苷的含有量明显高于七月菊，但木犀草素的含有量低于后者。

表3 4 种化学成分的加样回收率试验结果Tab.3 Result of recovey tests of four chemical constituents

表4 4 种化学成分含有量的分析结果Tab.4 Analysis result of the contents of four chemical constituents

图2 绿原酸、木犀草苷和3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸含有量的趋势图Fig.2 Content trendgram of chlorogenic acid，galuteolin and 3，5-dicaffeoyl quinic acid

图3 木犀草素含有量的趋势图Fig.3 Content trendgram of luteolin

3 讨论

近年来，人们为了迎合市场需求而大量种植七月菊，并利用其产量大、价格低的优势逐渐占据市场，形成了与黄山贡菊“平分天下”的趋势。然而，由于黄山贡菊缺少专有的质量评价体系，使其与七月菊难以区分，严重阻碍影响了这一优质道地植物的发展持续性和质量稳定性［13］。

本实验通过HPLC 法，对21 批黄山贡菊和12批七月菊中绿原酸、木犀草素、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含有量进行了测定，结果发现《中国药典》2010 年版中的方法无法将黄山贡菊色谱图上这4 种成分的色谱峰完全分离。因此，通过调整样品的提取方法、流动相和梯度洗脱顺序，使得各色谱峰的分离度提高，其中七月菊中木犀草苷的含有量为0.31 ～1.21 mg/g，显著低于黄山贡菊中的2.26 ～8.12 mg/g，但前者中木犀草素的含有量为0.03 ～0.73 mg/g，整体上高于后者中的0.07～0.28 mg/g。由此，根据这两种成分含有量的不同，可寻找出两种属菊花之间的差异，为黄山贡菊质量标准的建立提供了依据。

同时，木犀草苷具有较强的呼吸道杀菌、增强毛细血管舒张、解热抗炎、抗肿瘤等作用，而木犀草素有着清热解毒、祛痰、镇咳、抗炎、抗过敏和增强免疫等活性［14-15］，故两者均可作为控制两种属菊花质量的指标性成分，为全面客观地评价其品质及临床应用提供了参考。

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