HPLC 法同时测定蒿甲醚合成液中的青蒿素、双氢青蒿素和β-蒿甲醚

王令兆， 吴洪达 ， 刘 柳， 刘含智， 刘天时

(广西科技大学生物与化学工程学院，广西 柳州545006)

青蒿素(artemisinin，ART)是我国科研工作者发现的一种抗疟药，具有低毒、高效、见效快等特点，但它在水中的溶解度很低，故作为抗疟药，其生物利用度不理想，复发性高。因此，科学家们合成了一系列青蒿素的衍生物［1］，其中蒿甲醚(artemether，ARM)的抗疟作用是青蒿素的6 倍，具有抗疟迅速、高效、安全、低毒且与大多数抗疟药无交叉抗性等优势，是世界卫生组织充分肯定和推广的特效抗疟药。

蒿甲醚可由青蒿素或双氢青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)合成，在制备过程中涉及到青蒿素、双氢青蒿素和β-蒿甲醚的定量测定。目前，这3 种成分含有量的测定方法很多，主要有分光光度法［2-4］、HPLC 法［5-9］等。其中，HPLC 法因其精密度高、稳定性好，以及易于分析测定，因此为最常见的方法，但它又存在待测物前处理复杂、检测成分单一、色谱峰拖尾、分析时间长等不足。

本实验改进了《中国药典》报道的方法［10］，建立了一种能同时测定蒿甲醚反应液中青蒿素、双氢青蒿素和β-蒿甲醚含有量的HPLC 法，解决了双氢青蒿素色谱峰拖尾的问题，同时还研究了其α和β 异构体在流动相中相互转化的问题。结果表明，该方法快速、准确，被测组分能在较大浓度范围内作定量分析。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 LC-20AT HPLC 色谱仪、SPD-20A 紫外检测器(日本岛津公司);自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试剂 青蒿素、双氢青蒿素、β-蒿甲醚对照品(均为HPLC 级)。乙腈为色谱纯(美国Tedia公司);硼氢化钠等均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司);二次蒸馏水(自制)。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 ODS-C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相为磷酸盐(20 mmol/L，pH 为5.0)-乙腈水溶液(40 ∶60);柱温25 ℃;检测波长210 nm;体积流量1.0 mL/min;进样量20 μL。

2.2 标准品溶液的配制 分别精密称取青蒿素40.0 mg、双氢青蒿素20.0 mg 和β-蒿甲醚对照品20.0 mg，用乙腈溶解，配制成8.0 mg/mL 青蒿素、4.0 mg/mL 双氢青蒿素和4.0 mg/mL β-蒿甲醚溶液。然后，精密量取以上溶液适量，混匀，稀释成系列质量浓度的混合溶液，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.3 反应样品待测溶液的配制 精密吸取反应后的样品溶液1 mL，加NaHCO3溶液淬火以终止反应，再用乙腈定容至5 mL，待样品中的无机盐析出后，取上层清液，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4 结果

2.4.1 线性关系 在“2.1”项色谱条件下，取“2.2”项下溶液适量，平行测定3 次，记录峰面积，再以对照品溶液质量浓度(y)分别对青蒿素峰面积、α-、β-双氢青蒿素峰面积之和以及β-蒿甲醚峰面积(x)进行线性回归，结果见表1。由表可知，在一定范围内，被测组分的质量浓度与峰面积均呈良好的线性关系。

2.4.2 精密度 在“2.1”项色谱条件下，取“2.2”项下溶液适量，平行测定3 次。结果，青蒿素、双氢青蒿素和β-蒿甲醚的相对标准偏差分别为1.2%、1.3%、1.2%，表明仪器精密度高，达到HPLC 分析的要求。

2.4.3 回收率 取低、中、高质量浓度的反应液样品各一份，测定其中青蒿素、双氢青蒿素和β-蒿甲醚的含有量，再按《中国药典》中的方法［10］，分别精密加入这3 种成分的对照品溶液，制备成9 个供试液，在“2.1”项色谱条件下进行测定，计算回收率，结果见表2。由表可知，三者的平均回收率分别为98.8%、99.2%、101.1%，相对标准偏差RSD 均小于2.55%，表明该方法回收率良好。

2.4.4 反应液样品的分析 取在20℃下反应1.0、1.5 和2.0 h 后的反应液，预处理后分别制成待测溶液，在“2.1”项色谱条件下分析，色谱图见图1，结果见表3。

在图1A 中，双氢青蒿素对照品出现峰1 (6.4 min)和峰2 (8.1 min)，这是由于β-双氢青蒿素在流动相中逐步转化为α-双氢青蒿素，表明在流动相中放置的时间越长，其α/β 构型的比值越大，在图中表现为峰1 面积增大，而峰2 面积减小，即前者是α-双氢青蒿素的响应峰，而后者是β-双氢青蒿素的响应峰，与文献［8-9］报道一致。另外，在图1B 中还发现，β-蒿甲醚色谱峰之前有两个新峰，统标为峰5 (t=15.4 min 和t=12.9 min)，可能是尚未确定的副产物色谱峰。

图1 混合标准品和样品的色谱图Fig.1 Chromatograms of mixed standard substances and samples

表2 青蒿素、双氢青蒿素和β-蒿甲醚的回收率(n=9)Tab.2 Recoveries of ART，DHA and β-ARM (n=9)

表3 样品的测定结果Tab.3 Determination result of samples

3 讨论

3.1 磷酸盐的作用 根据《中国药典》中的方法［10］，HPLC 分析青蒿素和双氢青蒿素的流动相为乙腈-水(60 ∶40)。但是，本实验发现在该流动相下，双氢青蒿素的色谱峰出现拖尾现象，无法完全分离α-和β-双氢青蒿素，见图2，而如果选择磷酸盐缓冲液为流动相时，则峰形明显好转，分离度提高，见图1A。推测拖尾现象出现的原因可能是双氢青蒿素分子中存在羟基，与固定相中的硅羟基有较强的亲和力，导致不易脱附，形成拖尾峰，而当流动相中存在磷酸盐时，磷酸氢根离子减弱了双氢青蒿素与固定相的吸附作用，提高其脱附速率，从而抑制拖尾现象，改善了分离效果。同时，由于双氢青蒿素和蒿甲醚在弱酸性环境下均比较稳定［11-12］，故选择NaH2PO4-Na2HPO4(pH 为5.0)-乙腈水溶液为流动相，可避免被测组分在洗脱分离过程中被分解或转化。

图2 乙腈-水(60 ∶40)为流动相时的HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of CH3CN ∶H2O (60 ∶40)as mobile phase

3.2 流动相配比的影响 本实验发现，当乙腈与缓冲盐的比例为40 ∶60 时，青蒿素、α-、β-双氢青蒿素和β-蒿甲醚的保留时间均过长，效果不理想。如果增加乙腈比例，则保留时间缩短，分离度提高，而当两者比例为60 ∶40 时，被测组分的色谱峰完全分开，峰型尖锐对称，理论塔板数均在7 000以上，保留时间较短，见图1A。然而，当两者比例为80 ∶20 时，β-双氢青蒿素和青蒿素的色谱峰出现重叠现象，分离度反而有所降低。

3.3 异构体相互转化对测定的影响 研究表明，双氢青蒿素在结晶状态时，以β 异构体存在，而在有机溶剂中，存在α 与β 异构体的相互转化，其反应速率受溶剂性质的影响，因此在对这两种异构体进行定量分析时，需考虑溶剂性质对其相对含有量的影响。文献［12-14］报道，在甲醇-水、乙醇-水以及乙腈-水等混合溶剂中，随着时间延长，α/β 比值不断增大，当最终达到平衡时，其比值与溶剂性质有关。陈有根等［15］报道，双氢青蒿素在乙腈中也存在转化现象，但转化速率较慢，在60 h 后才达到平衡(α/β=2.11 ∶1)。本实验研究了双氢青蒿素异构体在乙腈-磷酸盐水溶液(60 ∶40)中相互转化的速率，结果见图3。

图3 流动相中双氢青蒿素α/β 值随时间的变化Fig.3 Change of α/β ratio of DHA in mobile phase with time

由图3 可知，双氢青蒿素在最初90 min 内的异构化速率较大，而在230 min 时达到平衡，α/β为3.22，故难以通过HPLC 法分别准确测定α-、β-双氢青蒿素的含有量。但是，吴婧等［16］发现，这两个异构体色谱峰面积的比值虽然会随时间而变化，但其峰面积总和不变，即两者的响应值相等。因此，可选两者的峰面积总和作为双氢青蒿素的定量基础。

另外，蒿甲醚也存在α 和β 异构体，但研究显示，β-蒿甲醚在乙腈-磷酸盐水溶液中较稳定。考虑到该化合物是相关药物的有效成分，故本实验只针对β-蒿甲醚进行定量分析研究。

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