GC-MS 法比较铁皮石斛试管苗不同部位中挥发油的成分

付 涛， 王志龙 ， 林 立， 何月秋

(宁波城市职业技术学院，浙江 宁波315502)

铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo为兰科石斛属多年生草本植物，又名“黑节草”、“耳环石斛”，为我国名贵中药材，在道家养生经典《道臧》中被列为中华九大仙草之首，在民间也有“仙草”之美誉［1］。近年来研究发现，铁皮石斛含有多糖、生物碱、黄酮、菲、氨基酸、微量元素等众多营养成分，具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、抗衰老、抗菌等作用［2-7］。目前，其全基因组已被云南有关科研组测序完成，并且绘制了相关精细图谱，发现48 200 个蛋白质编码基因，在目前所有已测序的植物中最多，可见铁皮石斛化学成分的多样性和复杂性。

野生铁皮石斛药用价值极高，但其生长条件十分苛刻，通常只开花难结果，结果率仅为17.3%，繁殖极为困难，因此产量稀少，更因民间长期无限制、掠夺性和毁灭性采挖，致使该植物资源濒临绝种［8］，1987 年被国务院列为珍稀野生药用植物加以保护。物以稀为贵，铁皮石斛因资源的极度匮乏和法律的严格限制而价格奇高，为了满足市场上对其日益高涨的需求，目前利用无性繁殖-组培快繁技术等对铁皮石斛进行繁殖，模拟最适宜其生长的基质、温度、光照和湿度等环境条件进行人工栽培，也可根据当地特色进行仿野生种植，这均大大提高了铁皮石斛的产量，极大地弥补了市场上供不应求的状态。

铁皮石斛全身都是宝，但一直以茎段为药用材料，叶、根或花应用较少。目前，已有人将叶、花做成叶茶、花茶，但加工不易，产量不高;根在传统上有较高评价，以外观“龙头凤尾”者为优，其中“头”为茎，而“尾”则为根，但迄今鲜见单独对根进行研究。目前，对铁皮石斛挥发油成分的研究相对滞后，尤其是针对其试管苗不同部位(根、茎和叶)，未见有国内外文献报道。因此，本实验通过研究铁皮石斛试管苗不同部位的挥发油成分，对有效利用该植物资源和开发其试管苗具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料 铁皮石斛试管苗来自宁波城市职业技术学院重点实验室组培室 (经度121.40、纬度29.65)，以道地铁皮石斛2 年生茎尖(节)为繁殖材料，组培时选择健壮、无病虫害者，以MS 为基本培养基，添加1 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、活性炭和花宝一号(N ∶P ∶K =7 ∶6 ∶19)适量，进行接种培养。当苗长3 cm、叶色正常且有4 ～5片、根有4 ～5 条且长3 cm 以上时，即可炼苗转移，进行挥发油成分的分析。

1.2 主要试剂与仪器 正己烷为色谱纯(德国Merck 公司);无水硫酸钠为分析纯(国药集团化学试剂有限公司);液氮。HP7890B GC system/5977A MSD GC-MS 联用仪(美国Agilent Technologies 公司);电子天平(瑞士Mettler-Toledo 公司);MLLI-Q-超纯水仪(美国Millipore 公司);水蒸气蒸馏装置、1.5 mL 进样瓶、一次性注射器和液氮罐等。

1.3 方法

1.3.1 铁皮石斛试管苗茎、根和叶挥发油的提取参考霍昕等［9-11］报道的方法，分别称取新鲜铁皮石斛试管苗的根、茎和叶100 g，液氮研磨成粉末状，置于烧瓶中，加纯净水800 mL、正己烷3 mL、沸石数粒充分摇匀，2 h 后常压水蒸气蒸馏，提取5 h，冷却静置1 h，排出水层，接收油层，用无水硫酸钠除水2 次，分别得到油状物0.7、0.8 和1.0 mL 用于进样，即得。

1.3.2 GC 条 件 Agilent 19091S-433 色 谱 柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm);柱温50 ℃;进样口温度250 ℃;柱内载气体积流量1.0 mL/min;载气为高纯氦气(99.999%);汽化室温度250 ℃;柱前压7.62 kPa;升温程序为从50 ℃开始保持1 min，以4 ℃/min速率升温至280 ℃，保持2 min;进样量1 μL;分流比10 ∶1。

1.3.3 MS 条件 EI 离子源;离子源温度230 ℃;接口温度250 ℃;电子能量70 eV;MS 四级杆温度150 ℃;调谐EMV 为1 149;溶剂延时2.6 min;扫描范围15 ～500 Amu。

1.4 数据处理 通过HP chemstation 检索Nist 05标准质谱图库和wiley 275 质谱图库，同时参考相关文献，确认铁皮石斛试管苗茎、根和叶的挥发性成分。然后，应用HP chemstation 数据处理系统，按峰面积归一化法计算出各化学成分的相对含有量，结果见表1 和表2。

表1 铁皮石斛试管苗不同部位中挥发油的种类及含有量Tab.1 Varieties and contents of volatile oils in different parts of Dendrobium officinale tube seedlings

表2 铁皮石斛试管苗不同部位中挥发油的成分及含有量Tab.2 Constituents and contents of volatile oils in different parts of Dendrobium officinale tube seedlings

2 结果与分析

铁皮石斛试管苗中共检测出54 种挥发油成分，分别为酯类 (7 种)、醇类 (12 种)、有机酸类(11 种)、萜烯类(13 种)、烷烃类(4 种)以及其他类(7 种)，具体见表1，其根、茎和叶挥发油的总离子流色谱图见图1。

图1 铁皮石斛试管苗根、茎和叶挥发油的总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatograms of volatile oils in roots，stems and leaves of Dendrobium officinale tube seedlings

另外，根中共检测到16 种挥发油成分，其中有机酸类含有量最高 (64.40%)，其次是酯类(12.48%)、烯萜类(4.31%)、烷烃类(4.13%)和醇类(2.41%)，其它类占12.18%。而且，亚油酸和棕榈酸所占比例最高，分别为29.23% 和25.72%，其次是l-(+)-抗坏血酸-2，6-二棕榈酸酯、1，54-二溴-五十四碳烷和十五烷酸，分别为12.48%、10.8%和7.99%;茎中共检测到45种，其中有机酸类含有量最高(53.48%)，其次是醇类 (20.66%)、烯萜类 (12.27%)、酯类(6.07%)和烷烃类(2.26%)，其它类占5.25%。而且，亚油酸和棕榈酸所占比例最高，分别为22.75%和16.51%;叶中共检测到10 种，其中有机酸类含有量最高，达96.04%，主要是亚油酸(45.54%)、棕 榈 酸 (37.4%) 和 十 五 烷 酸(11.04%)，但其他类仅占6.02%，包括烷烃类(1.43%)、烯萜类 (1.08%)、醇类 (0.54%)，其他占0.89%，并且不含酯类。

由表2 可知，根和茎有9 种共有成分，分别为β-杜松萜烯、榄香醇、毕橙茄醇、正三十七烷醇、十五烷酸、棕榈酸、l-(+)-抗坏血酸-2，6-二棕榈酸酯、亚油酸和二十七烷;茎和叶有5 种，分别为亚油酸、棕榈酸、十五烷酸、二十七烷和E，E，Z-1，3，12-十九碳三烯-5，14-二醇;根和叶有7种，分别为亚油酸、棕榈酸、十五烷酸、二十七烷、十四烷酸、17-三十五碳烯和1，54-二溴-五十四碳烷;根、茎和叶中也有4 种，分别为亚油酸、棕榈酸、十五烷酸和二十七烷。综上所述，茎中挥发油的种类远多于根和叶，存在两者中不含有的成分，虽然茎中醇类和萜烯类的相对含有量低于有机酸类，但种类比有机酸(9 种)多，分别有11 种和10 种，表明茎中除有机酸类以外，醇类和萜烯类也是其挥发油的重要组成部分;根中醇类和萜烯类分别有4 种和3 种，与有机酸类相当，但相对含有量较低，酯类虽仅有1 种，但相对含有量较高(12.48%)，为l-(+)-抗坏血酸-2，6-二棕榈酸酯，并且卤代烃含有量也较高(10.8%)，为1，54-二溴-五十四碳烷，表明根中除有机酸类以外，酯类、烃类、烃类衍生物也是其挥发油的重要组成部分;叶中无论是在相对含有量还是在种类数量上，有机酸类都占绝大多数，表明它是叶中挥发油的最主要成分。

3 讨论

邵进明等［12］采用固相微萃取法分析得出，2年生铁皮石斛的茎、叶中均含有柠檬油精、壬醛、顺-3-己烯醇等成分。康联伟等［13］采用相同方法发现，铁皮石斛的挥发性成分主要为醛类、醇类、酮类、烯烃类和酯烃类化合物，另外还指出［14］，愈伤组织挥发性成分主要为烯烃类物质，而试管苗以醛类物质为主。霍昕等［9］采用有机溶剂-水蒸气蒸馏法分析显示，铁皮石斛花中挥发油的成分主要为醛类、酯类、醇类和酮类等物质。杨柳等［10］采用正己烷蒸馏法发现，铁皮石斛茎中挥发油的成分包括烷烃、酸、烯烃、酯、甾醇、二萜、蒽醌等。然而，本实验在铁皮石斛根、茎和叶的挥发油中均未发现醛类成分，可能与实验方法(邵进明、康联伟等采用固相微萃取法)和试验材料(霍昕等采用花)的差异有关，但与杨柳等(试验方法和部分取材部位均一致)报道一致，均不含醛类等低沸点成分。

植物香气的产生机制非常复杂，可能是由几种主要特征香气成分决定，也可能是由各种成分通过融合、叠加、掩盖等相互作用而表现出来［15-16］。本实验表明，虽然根、茎、叶中共有的4 种成分(亚油酸、棕榈酸、十五烷酸和二十七烷)占挥发油绝大多数，但茎中挥发油成分的种类远多于根、叶，尤其是萜烯类和烯醇类。其中，前者有α-衣兰油烯、β-毕澄茄烯、γ-衣兰油烯、γ-杜松萜烯、γ-雪松烯、γ-榄香烯、松柏烯、环氧石竹烯和桃柘酚等，而后者有β-桉叶油醇、γ-桉叶油醇、δ-柏木醇、芳樟醇、松烷醇、叔十六硫醇和3-脱氧雌二醇等，虽然其含有量均较低，但对该植物特殊气味的形成具有重要作用;根中有茎、叶不存在的物质，如T-依兰油醇、二十六碳烯、二十九碳烷和2，2＇-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)等;叶中有特定成分，如鲨烯和硬脂酸。由于萜烯类化合物是具有很强生理活性的一类物质，为中草药的重要组成成分，有着很强的杀菌、消炎、止痛、抗癌等作用，因此我国长期使用铁皮石斛的茎作为药用材料具有一定的科学依据。

另外还发现，无论是茎、根或者叶，其最主要成分均为亚油酸、棕榈酸等有机酸，尤其是在叶中含有量极高(96.04%)。据文献报道［17］，这些成分有一定的抗动脉粥样硬化作用，因此除茎外，根和叶也可加以利用，应用于食品、化工等行业，如作为茶、香料的成分或化妆品等。铁皮石斛试管苗的挥发油中有许多既是活性药理成分，又是香料成分，但其具体作用机制目前尚不清楚，有待于作进一步研究。为了有效地开发利用铁皮石斛，以期用其试管苗代替或部分代替野生种质，缓解该植物资源贫乏的现状，有必要对其化学成分展开深入的研究。本实验通过对铁皮石斛试管苗挥发油成分进行研究，可为今后进一步开发利用该资源提供科学依据。而且更为重要的是，它可作为评价不同种质铁皮石斛试管苗品质的一个重要指标，由于出苗后不同的生长环境和管理方式对其品质有着重要的影响，故在试管苗即将出苗时对该植物的化学成分进行测定，能准确了解其品质优劣，对优质铁皮石斛资源的筛选、推广和应用均具有十分重要的意义。

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