苦瓜根总皂苷的提取及其对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的研究

彭晓赟， 陈紫东， 尹志芳， 钟桐生， 杨小琴， 赵运林*

(1. 湖南城市学院化学与环境工程学院，湖南益阳413000;2. 陕西省榆林市农业科学研究院，陕西榆林719000)

苦瓜Momordica charantia L 属于葫芦科植物，广泛种植于热带和亚热带地区，是人们生活中的一种常用蔬菜，同时也是功能食品原料［1-2］。皂苷是存在于植物界的一类比较复杂的化合物，是由皂苷元和糖基部分组成，苦瓜中的这类物质主要为三萜类和甾体类皂苷［3-6］，其结构比较复杂，由于自身的羟基结构可能是某种酶的作用位点，因而具有良好的生理活性，研究表明，苦瓜皂苷具有降血糖的作用［7-11］。体外α-葡萄糖苷酶抑制试验可以从一定程度上反映活性物质通过抑制糖苷酶活性而发挥降血糖作用，是一种较为快捷的降糖药物筛选方法［12-14］。目前，对苦瓜皂苷的研究多集中在果实和种子部位，而仅有陈林等人对其根部做过皂苷含有量和不同溶剂提取物的降糖活性研究［15-16］，故为了开发利用苦瓜根资源，本实验在此基础上优化了正交试验，对影响苦瓜根总皂苷提取效果的温度、浸泡时间、乙醇体积分数和料液比这四个因素进行考察，选择最佳提取工艺，并以人参皂苷Rb1为指标，采用高氯酸-香草醛-冰醋酸比色法对其含有量进行测定。同时，以体外α-葡萄糖苷酶抑制率为指标，评价苦瓜根总皂苷的降血糖效果，旨在为进一步合理利用苦瓜资源奠定基础。

1 实验

1.1 材料与试剂 苦瓜根(湖南城市学院周边农田)。无水乙醇、石油醚、甲醇、正丁醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸、碳酸钠等均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。96 孔板(美国Corning Costar 公司);α-葡萄糖苷酶、对-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷、DMSO (美国Sigma 公司);牛血清白蛋白(国药集团化学试剂有限公司);阿卡波糖(美国TCI 公司);人参皂苷Rb1对照品(纯度≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司)。

1.2 仪器与设备 UV3010 紫外可见分光光度计(日本岛津公司);GZX-9076MBE 数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司);AvantiJ25 高速冷冻离心机(美国Beckman 公司);旋转蒸发仪(上海雅荣生化设备仪器有限公司);中药粉碎机(北京兴时利和科技发展有限公司);W-O 型数显恒温水浴锅(江苏省金坛市金祥龙电子有限公司);SHZ-D (Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器有限公司);电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);FD-1PF 真空冷冻干燥机(北京德天佑科技发展有限公司);MultiSkan FC 酶标仪(美国热电公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 苦瓜根总皂苷的提取方法 (1)苦瓜根原料前处理。将苦瓜根洗净，阴干，40 目筛粉碎，得到苦瓜根粉，密封保存备用。(2)苦瓜皂苷的定量分析。按照崔恒林等报道的方法［17］提取苦瓜根中的总皂苷，提取液依次经石油醚和水饱和正丁醇萃取后，正丁醇部位经60 ℃减压浓缩，得到褐色稠状物，用甲醇溶解，丙酮充分搅拌使其产生沉淀，离心，将沉淀冷冻干燥，计算提取率。然后，将粗皂苷用甲醇稀释至1.000 mg/mL，利用高氯酸-香草醛-冰醋酸法［17］测定其在552 nm 下的吸光度，并计算皂苷含有量。

1.3.2 正交试验优化苦瓜皂苷的浸提工艺 影响苦瓜根总皂苷提取的因素很多，根据文献［15，17-19］报道的单因素试验及预试验来确定因素范围，选择A (浸提温度)、B(浸提时间)、C (乙醇体积分数)、D (料液比)作为考察因素，以总皂苷含有量为指标，对提取工艺参数进行四因素四水平优化，实验方案见表1。

表1 L16(45)正交实验设计方案

1.3.3 苦瓜根总皂苷抑制α-葡萄糖苷酶的测定方法 参考Feng 等［20］建立的96 微孔板试验法，测定最优提取条件下总皂苷对α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果。总反应体系为240 μL，其中含0.01 mol/L、pH 为6.8 磷酸钾缓冲液120 μL (样品溶解在此溶液中)，加入0.8 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液20 μL (α-葡萄糖苷酶用含0.2% BSA 的0.01 mol/L、pH 为6.8 的磷酸钾缓冲液配制)，37 ℃下恒温反应15 min后加入5.0 mmol/L PNPG 溶液20 μL (PNPG 用0.1 mol/L、pH 为6.8 的磷酸钾缓冲液配制)，37 ℃下恒温反应15 min，再加入0.2 mol/L Na2CO3溶液80 μL，在405 nm 波长下测OD 值，每个样品平行测定3 次。同时，制得相同体系下的样品空白组，酶与底物用0.01 mol/L、pH 为6.8 的磷酸钾缓冲液代替背景组、不加样品的阴性对照组和以阿卡波糖为抑制剂的阳性对照组，并用Sigma Plot 10.0 软件拟合非线性方程，计算IC50值。酶活性抑制率公式为酶活性抑制率= ［OD 阴性- (OD 样品阴性- OD 样品背景)］ /OD 阴性×100%

2 结果与分析

2.1 正交试验结果 根据表1 中的试验因素设计方案，加E 误差列，套用L16(45)正交试验表，以总皂苷含有量为指标，结果见表2 和表3。通过正交试验来比较各因素的极差值，发现其大小依次为C ＞D ＞B ＞A，即影响苦瓜根总皂苷提取率的试验因素顺序为C (乙醇体积分数)、D(料液比)、B (浸提时间)、A (浸提温度)，由方差分析结果可知，这四个因素对提取效果均无统计学意义(P ＞0.05)。综上所述，最佳提取工艺是A1B1C3D1，即乙醇体积分数70%、料液比1 ∶5、浸提时间6 h、浸提温度40 ℃。

2.2 苦瓜根总皂苷的验证试验 在上述工艺条件下，10 g苦瓜根粉平均得到的总皂苷提取物为0.23 g，得率为2.3%。经比色分析，总皂苷含有量为0.98 mg/mL，纯度达到98%，优于陈林等［8］报道的结果。

2.3 苦瓜根总皂苷对α-葡萄糖苷酶活性的影响 α-葡萄糖苷酶是一种存在于小肠绒毛黏膜细胞刷状缘的酶类，可催化淀粉、麦芽糖或其他碳水化合物非还原末端的α-1，4-糖苷键水解，并释放出葡萄糖酶，而其抑制剂通过可逆性或竞争性抑制小肠刷状缘上α-葡萄糖苷酶的活性，延缓或抑制葡萄糖在肠道内的吸收，从而减缓餐后血糖的升高［21］。

表2 正交试验结果

表3 方差分析

由表4 可知，苦瓜根总皂苷与阳性对照阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用均呈一定量效关系，即均随抑制剂质量浓度的增加而显著上升，虽然苦瓜根总皂苷对α-葡萄糖苷酶有一定程度的抑制作用(IC50=1 538 μg/mL)，但活性明显弱于阿卡波糖(IC50=454 μg/mL)。由此可知，苦瓜根总皂苷对α-葡萄糖苷酶的抑制活性相当于阿卡波糖的1/3左右，与王琪等［8］报道的苦瓜果实皂苷的抑制活性结果相一致，推测其活性可能与皂苷的构型有关。陈林等［3，22-23］发现，苦瓜根中含有三萜皂苷，其结构中的羟基、阳离子、三角形异头碳中心、共价连接环所形成的半椅状或椅状构型，均能与酶有很好的结合能力，从而降低其活性。

表4 阿卡波糖与苦瓜根总皂苷对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

3 结论

本实验以苦瓜根总皂苷的含有量为指标，对提取工艺进行优化，发现最佳提取工艺条件为浸提温度40 ℃、浸提时间6 h、乙醇体积分数70%、料液比1 ∶5。在此条件下，总皂苷得率为2.3%，含有量为0.98 mg/mL，纯度达98%，优于王琪等［8］研究报道，推测除了供试材料的品种、地域差异、植株生产年限等因素外，可能还与试验设计的各因素水平有关。

对总皂苷进行了α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究，结果发现该条件下所得总皂苷的抑制活性均与抑制剂的质量浓度呈正相关性，即具有剂量依赖性，因此有着较好的开发价值。虽然IC50值可较好地评价提取物的活性，但仍存在一定片面性，因此评价抑制剂活性时，应从多方面进行综合评价。

综上所述，苦瓜根总皂苷具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可采用活性追踪方法对其提取物进行进一步的分离纯化研究。

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