鲍曼不动杆菌疫苗研究进展

李海涛， 潘频华

·综述·

鲍曼不动杆菌疫苗研究进展

李海涛， 潘频华

鲍曼不动杆菌； 疫苗； 蛋白

鲍曼不动杆菌存在于医院环境并在患者多部位定植，导致医院获得性肺炎、血流感染、腹腔感染、脑膜炎、皮肤软组织感染和泌尿系感染等［1］。由于其强大的获得耐药性及克隆传播能力，鲍曼不动杆菌已成为全球流行并呈高度耐药的常见致病菌［2］。在我国，鲍曼不动杆菌已经成为医院感染最常见的病原菌之一，2012年我国9省市15所教学医院临床检出的革兰阴性菌标本中，鲍曼不动杆菌达15.05%，仅次于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，其中大多数为多重耐药菌［3］。在部分重症监护病房，多重耐药鲍曼不动杆菌已居医院感染的第1位［4］。需要警惕的是，耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染率持续上升，并逐渐成为最常见的基因表型［5-6］。由于鲍曼不动杆菌耐药性日趋严重，新的有效抗菌药物研发迟滞，近年，国外许多学者尝试通过研制针对性细菌疫苗的手段来防治鲍曼不动杆菌，现就鲍曼不动杆菌疫苗研制的新进展综述如下。

1 灭活疫苗

灭活全菌体（inactivated whole cell，IWC），作为最简单快捷的人工免疫方式，以灭活病原微生物制备抗原诱导免疫应答预防感染是优先考虑的方法。McConnell等［7］和Harris等［8］分别以腹腔接种和鼻内接种方式构建鲍曼不动杆菌感染小鼠肺炎模型，并分别以ATCC 19606毒株和LAC-4毒株制备甲醛灭活全菌体疫苗并肌注免疫小鼠。在接种IWC的小鼠可以观察到明显的主动免疫，表现为；①免疫后在小鼠体内可以检测到明显的特异性抗体升高；②免疫小鼠组织细菌负荷量，及血清细胞因子明显减少；③以不同鲍曼不动杆菌毒株感染小鼠，IWC免疫组小鼠生存率接近100%，而未免疫组小鼠则不足20%。研究同样表明，注射IWC抗血清后再感染鲍曼不动杆菌小鼠未出现感染死亡，说明IWC抗血清具有明显的被动免疫保护作用。IWC的主动和被动免疫均对鲍曼不动杆菌感染有保护作用。KuoLee等［9］最近的研究指出，IWC滴鼻亦能诱导体液免疫的产生，但与黏膜免疫相关的sIgA并无明显升高，且免疫血清无被动免疫保护作用。IWC虽然有明显的主动及被动免疫保护作用，但问题也很明显；①IWC免疫原性不强，需大剂量多次接种；②IWC在制作过程中可能出现导致灭活不完全，接种免疫后危及患者生命；③IWC无效成分过多，其中内毒素可能加重患者病情。

2 外膜蛋白疫苗

2.1 外膜复合物（outer membrane complex，OMC）

为解决以上问题，McConnell等［10］进一步提出OMC可能成为一个较为安全的鲍曼不动杆菌候选疫苗。OMC为超速离心提取自鲍曼不动杆菌外膜，其包含细胞膜上多个蛋白质成分，具有一定的免疫原性。选择ATCC 19606毒株提取OMC，免疫小鼠后发现；①单次免疫效果良好，能诱导小鼠体液免疫及细胞免疫（反映指标为IgG及INF-α明显升高）；②降低小鼠感染后组织细菌负荷量及炎性因子水平；③OMC能保护小鼠免于鲍曼不动杆菌致死感染；④小鼠OMC抗血清保护小鼠免于鲍曼不动杆菌感染引起脓毒症所致死亡，有明显的被动免疫保护作用。该研究结果与IWC研究结果［7］高度一致，从安全性考虑而言，OMC较IWC为优。

2.2 外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMV）

OMV是由革兰阴性菌外膜外翻分泌形成，其中包裹了大量的外膜蛋白、间质蛋白和脂多糖。Bomberger等［11］的研究表明，由于OMV能与宿主细胞外膜融合，提示OMV可能远距离输送细菌产物，也解释其群体感应（quorum sensing）、毒力因子传播、基因-基因转换等作用，表明在细菌致病过程中OMV发挥了重要作用。McConnell等［12］研究提示，OMV同样也能成为鲍曼不动杆菌候选疫苗。其作为候选疫苗优势在于；①OMV中内毒素水平可控制在（1.3 ±0.01）×105EU/μg，较IWC和OMC明显降低；②OMV接种后同样引起小鼠体液免疫应答，而且二次强化免疫后能明显增加特异性IgG和IgM水平；③OMV接种后降低了小鼠感染后组织细菌负荷量及炎性因子水平（IL-1β、IL-6）；④OMV诱导保护性免疫，明显降低了鲍曼不动杆菌脓毒症小鼠模型死亡率。另外，OMV制备只需过滤鲍曼不动杆菌上清液并加以浓缩便可，方法简单而快速。但OMV抗血清没有被动免疫保护作用；通常对来自所提取的单克隆特异性毒株免疫效果最佳，因而，可能更适用鲍曼不动杆菌感染暴发时快速制备OMV预防新的感染；虽然OMV内毒素水平低于IWC和OMC，但仍然超过了人体所能承受的水平。

IWC、OMC和OMV均属于多抗原成分，其优势在于能有效地避免因多克隆毒株的存在使得疫苗效果降低。实验结果表明，其对鲍曼不动杆菌的其他血清型所致脓毒症感染也有保护作用［7-8，10，12］，原因可能是多抗原成分发挥的交叉免疫作用，也可能是其中存在高度保守基因所编码的抗原成分；其缺点同样明显；由于其所含成分繁多且复杂，在生产过程中难以标准化疫苗剂量；而且其中脂多糖（内毒素）含量超过了人体所能承受的上限，限制了在人体中的应用。或许通过灭活鲍曼不动杆菌中编码脂多糖合成途径的相关基因，获得相应疫苗是减低内毒素水平的可行方式之一。

3 重组蛋白疫苗

3.1 生物膜相关蛋白（biofilm associated protein，Bap）

由于IWC、OMC和OMV在临床应用推广受限以及对鲍曼不动杆菌研究的深入，成分单一、免疫原性强的亚单位蛋白疫苗成为研究热点。Bap是一种特异的细胞表面蛋白，与鲍曼不动杆菌生物膜早期形成及成熟相关，在细菌感染过程中起重要作用。Fattahian等［13］以重组亚单位Bap免疫小鼠3次，ELISA证实了小鼠体内产生对Bap的体液免疫，Bap特异性IgG抗体效价较对照组明显升高；免疫后小鼠在接种半数致死剂量细菌（107）18 h后组织细菌计数明显减少，而未免疫小鼠此时均已死亡，提示Bap能有效降低小鼠免于鲍曼不动杆菌脓毒症感染所致死亡的风险。Bap作为传统疫苗的免疫优势区是保守的，在不同毒株中存在相同的免疫表型（Bap诱导抗体对Kh0058、Kh0059、Kh0097、Kh0099等毒株均有效），使得Bap作为疫苗能对抗多个鲍曼不动杆菌克隆毒株。但抗Bap血清不能发挥被动免疫保护功能。

3.2 外膜蛋白A（outer membrane protein，Omp A）

OmpA是目前明确的毒力因子，在鲍曼不动杆菌外膜中含量丰富［14］，且在不同鲍曼不动杆菌毒株中氨基酸序列高度保守，PubMed BLAST检索结果证实其人类蛋白组学同源性最小，避免诱发产生自身抗体的可能。Luo等［15］以重组Omp A（rOmpA）免疫糖尿病小鼠后发现；①rOmp A诱发了明显的体液免疫，表现为抗rOmp A抗体效价明显增高，小鼠28 d生存率由0提高到50%左右，且rOmp A抗体效价与小鼠的存活率呈正相关；②同时明显降低脑、肾、肝、脾组织细菌负荷量（但肺组织中细菌负荷量的下降无统计学意义）。另外，作者亦研究了rOmp A抗血清的免疫治疗作用，虽然免疫血清不能增强补体介导的杀菌作用，但rOmp A抗体能增强巨噬细胞调理吞噬杀伤鲍曼不动杆菌，从而发挥免疫调理作用。鲍曼不动杆菌菌落培养上清液所获得的OmpA是水溶性并具有生物活性，但原核表达rOmp A则不溶于水［16］，因此在其表达上仍需进一步研究。

3.3 三聚体自转运蛋白（trimeric autotransporter protein Ata）

Ata，一种鲍曼不动杆菌表面蛋白成分，附着于许多细胞外基质或基膜蛋白，是形成致病力、生物菌膜及对Ⅳ型胶原纤维黏附所必需［17］。Bentancor等［18］的研究显示；①Ata抗体可以阻碍鲍曼不动杆菌黏附Ⅳ型胶原纤维，从而减低鲍曼不动杆菌致病力；②Ata抗体不但可以促进多核中性粒细胞（PMNs）调理吞噬杀伤鲍曼不动杆菌，还能介导补体依赖的杀菌作用；③抗Ata血清可以降低小鼠感染后组织细菌负荷量，提示Ata是一个保护性免疫的重要靶点。

Bap、Omp A、Ata均为保守基因表达产物，具有高度同源性，并覆盖了较大部分的鲍曼不动杆菌毒株，表现了良好的免疫效果，是潜在疫苗候选抗原。基因工程重组技术生产疫苗具有成分单一、重复性好、产品批间差异小、易于控制细菌内毒素含量等优势，不存在疫苗剂量定量的困扰，是现代疫苗开发的重要方向之一。但单一成分疫苗可能免疫保护不足，或者将鲍曼不动杆菌置于强大的选择压力下诱导细胞膜靶向蛋白下调，出现免疫逃避导致疫苗最终失效。因此，筛选保守性好、免疫原性强的抗原，以便进行多抗原组合，是研制重组蛋白疫苗需重点解决的问题。

4 多糖疫苗

4.1 多聚-N-乙酰β葡聚糖（Poly-N-acetyl-βglucan，PNAG）

PNAG是一种表达于多株临床分离的鲍曼不动杆菌表面的多糖，在体外生物膜的形成发挥了重要作用［19］。由于PNAG抗原性弱，Bentancor等［20］将合成PNAG与破伤风类毒素偶联形成结合疫苗后，免疫兔并提取抗PNAG血清，被动免疫小鼠发现；①PNAG抗体可以高效介导多形核中性粒细胞（PMNs）的调理杀菌作用；②被动免疫后感染鲍曼不动杆菌的小鼠组织细菌负荷量明显降低，发挥了保护性抗体作用。提示PNAG是一种潜在的候选疫苗抗原，有可能在主动免疫和被动免疫中发挥保护作用。

4.2 K1荚膜多糖

鲍曼不动杆菌细胞膜外还表达多种荚膜多糖，其中K1荚膜多糖与鲍曼不动杆菌的毒力密切相关，且不会诱导人体产生自身免疫［21-22］。Russo等［23］通过纯化的K1荚膜多糖免疫小鼠并获得抗K1荚膜多糖血清以验证其被动免疫效果。实验结果表明，在体外实验中抗血清可以增强PMNs介导的调理吞噬作用，增强细菌清除率。但是，只有13%鲍曼不动杆菌为K1血清型，因此，K1荚膜多糖疫苗只适用于特定毒株，不能发挥有效的预防感染作用。

荚膜多糖主要诱导抗体产生调理作用杀伤鲍曼不动杆菌，相比较抗原性较弱，且保守性欠佳，并不是疫苗制备的最佳选择，但丰富了疫苗选择的思路。

几乎所有成功的疫苗，人们均熟知自然免疫对抗感染的全过程，并尽量模仿其保护性免疫反应。虽然目前鲍曼不动杆菌疫苗的研究取得了一定的进展，但许多技术依然陈旧，已不能满足新疫苗开发的要求。近年来，逆向免疫学及蛋白质组学的兴起为疫苗制备指明了新的道路，通过对鲍曼不动杆菌保守位点的定位和基于结构的设计，国外学者从理论上筛选出多种鲍曼不动杆菌候选疫苗抗原［24］，Omp A、Bap亦位列其中。由于鲍曼不动杆菌基因组表达的多样性及不稳定性，多个亚单位的组合疫苗或许是未来鲍曼不动杆菌疫苗研究的重要方向。同时，目前已明确的抗体在动物实验中表现出了良好的保护作用，开发特异性免疫球蛋白制剂甚至单克隆抗体制剂用于治疗的被动免疫方法或将成为研究方向之一。

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Research progress of the vaccine against Acinetobacter baumannii

LI Haitao，PAN Pinhua.（Department of Respiratory and Critical Care Medicine，Central South University Xiangya Hospital，Changsha 410008，China）

R378

A

1009-7708（2015）02-0188-04

2014-05-20

2014-07-24

湖南省科技厅社会发展支撑课题（2013SK3023）。

中南大学湘雅医院呼吸与危重症医学科，长沙410008。

李海涛（1989—），男，硕士，医师，主要从事肺部重症感染诊治研究。

潘频华，E-mail；pinhuapan668®hotmail.com。