银线草化学成分及生物活性研究

·中药及天然药物·

银线草化学成分及生物活性研究

路强强，石新卫*，上官建国，周军辉，崔新爱

(陕西省西安植物园，陕西省植物研究所，西安710061)

摘要：目的对银线草的化学成分及海虾致死活性进行研究。方法利用正、反相柱层析等色谱手段进行分离纯化；通过核磁共振谱、质谱等光谱数据鉴定化合物结构；采用96孔板稀释法进行海虾致死活性测试。结果从银线草乙酸乙酯萃取部分分离得到5个化合物，其结构分别鉴定为：银线草醇B(shizukaol B，1)；银线草内酯G(shizukanolide G，2)；银线草内酯H(shizukanolide H，3)；β-谷甾醇(β-sitosterol,4)；卡瓦胡椒素A(flavokawain A，5)。结论化合物2，3和5首次从该植物中分离得到；化合物1具有较强的海虾致死活性(LC50﹤5 mg·L-1)。

关键词：银线草；化学成分；生物活性

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.001

中图分类号：R284文献标志码：A

基金项目：国家自然科学

作者简介：路强强，男，硕士，实习研究员

收稿日期：(2015-04-29)

Study on chemical constituents and bioactivity ofChloranthusjaponicus

LU Qiangqiang，SHI Xinwei*，SHANGGUAN Jianguo，ZHOU Junhui，CUI Xin′ai (Xi′an Botanical Garden of Shaanxi Province，Institute of Botany of Shaanxi Province，Xi′an 710061， China)

Abstract:ObjectiveTo study the chemical constituents of Chloranthus japonicus, which cause brine shrimp (Artemia salina) to death. MethodsThe chemical constituents were isolated and purified by various chromatographic techniques，and their structures were elucidated on the basis of nuclear magnetic resonance and mass spectroscopic analysis. The brine shrimp lethality were tested by 96-well plate dilution method. Results5 compounds were obtained from the ethyl acetate extracts，and their structures were elucidated as: shizukaol B (1)，shizukanolide G (2)，shizukanolide H (3)， β-sitosterol (4)，and flavokawain A (5). Conclusion

Compounds 2，3 and 5 were isolated from this plant for the first time, and compound 1 showed significant brine shrimp lethality，with the lethal concentration 50 (LC50) less than 5 mg·L-1.

Key words:Chloranthusjaponicus；chemical constituents；bioactivity

*通信作者：石新卫，男，博士,助理研究员

银线草 (ChloranthusjaponicusSieb.) 又名白毛七、四块瓦、四叶细辛、四大天王，属金粟兰科金粟兰属多年生草本植物，分布于陕西、甘肃等地，全株供药用，具有祛湿散寒、活血止痛、散瘀解毒等功效，用于治疗风寒咳嗽、跌打损伤、痈肿疮疖、妇女经闭等情况[1-4]。研究表明，银线草主要含有金粟兰内酯、银线草内酯、银线草醇、银线草呋喃醇、银线草螺二烯醇等倍半萜二聚体和单萜类化学成分[5-8]。现代药理研究表明，银线草提取物具有抗菌、抗HIV病毒复制和细胞毒活性[9-11]。为了进一步探究银线草药理作用的物质基础，开发利用这一药用植物资源，本实验利用正相硅胶、RP-18反相硅胶、MCI树脂、Sephadex LH-20凝胶等分离材料，采用常压、减压等柱色谱技术对银线草化学成分进行分离纯化，从其乙酸乙酯萃取物中获得了6个化合物，经波谱技术鉴定其结构分别为：银线草醇B (shizukaol B，1)；银线草内酯G (shizukanolide G，2)；银线草内酯H (shizukanolide H，3)；β-谷甾醇 (β-sitosterol，4)；卡瓦胡椒素A (flavokawain A，5)。化合物2，3和5首次从银线草 (Chloranthusjaponicus) 中分离得到，采用96孔板稀释法对其海虾致死活性进行测试。化合物1的海虾致死活性与阳性对照品鬼臼毒素 (podophyllotoxin) 相当，LC50值均小于5 mg·L-1，化合物2～5的LC50值分别为73，48，76和52 mg·L-1。

1仪器与材料

1.1仪器Bruker AM-400和Bruker AV-500核磁共振波谱仪(瑞士布鲁克公司)；ThermoFisher Q-Exactive质谱仪(美国赛默飞世尔公司)；Waters Xevo G2 Q-TOF-MS质谱仪 (美国沃特斯公司)；Eyela N-1100旋转蒸发仪(东京理化公司)；X-5显微熔点测定仪(巩义予华仪器有限公司)。

1.2材料柱色谱正相硅胶(100～200，200～300目)和薄层色谱硅胶GF254(青岛海洋化工厂)；RP-18反相硅胶(25～40，40～63 μm，日本YMC公司)；Sephadex LH-20凝胶(美国法玛西亚公司)；MCI树脂(75～150 μm，日本三菱公司)；所用试剂均为分析纯(天津科密欧化学试剂有限公司)；实验用银线草于2012年10月采自陕西秦岭太白山，经陕西省西安植物园周亚福博士鉴定为金粟兰科金粟兰属植物银线草(Chloranthusjaponicus)。

2提取与分离

将银线草全草20 kg粉碎，甲醇回流提取3次(150 L×3)，每次2 h，滤过，合并滤液，减压浓缩得到浸膏1.5 kg，以2.5 L水溶解浸膏，依次用2.5 L石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取5次，合并萃取液，减压浓缩得各组分浸膏。其中乙酸乙酯浸膏370 g，经正反相硅胶、MCI树脂、Sephadex LH-20凝胶等色谱柱层析，以石油醚-乙酸乙酯、石油醚-三氯甲烷-丙酮、三氯甲烷-甲醇体系反复纯化，得到化合物1 (44 mg)，化合物2 (25 mg)，化合物3 (35 mg)，化合物4 (2.1 g)，化合物5 (20 mg)。

3结构鉴定

化合物1白色无定形粉末(三氯甲烷)，易溶于三氯甲烷、甲醇，C40H44O13，mp：117～119 ℃，HR-ESI-MSm/z: 755.267 4 [M+Na]+，756.270 0 [M+Na+H]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δppm: 6.63(1H，t，J=6.9 Hz，H-c)，5.08(1H，d，J=12.0 Hz，H-13′β)，5.07(1H，dd，J=14.9，4.7 Hz，H-dβ)，4.64(1H，dd，J=14.7，6.8 Hz，H-dα)，4.56(1H，d，J=11.8 Hz，H-15′β)，4.54(1H，d，J=12.3 Hz，H-13′α)，3.95(1H，s，H-6)，3.88(1H，s，H-9)，3.70(3H，s，H-OMe)，3.65(1H，d，J=11.8 Hz，H-15′α)，2.89(1H，dd，J=16.8，10.2 Hz，H-gβ)，2.81(1H，d，J=16.2 Hz，H-15α)，2.79(1H，d，J=8.0 Hz，H-hβ)，2.71(1H，dd，J=18.7，4.9 Hz，H-6′β)，2.67(1H，dd，J=16.1，8.1 Hz，H-hα)，2.59(1H，d，J=16.1 Hz，H-15β)，2.48(1H，dd，J=18.6，4.8 Hz，H-6′α)，2.48(1H，dd，J=18.6，4.8 Hz，H-gα)，2.05(1H，d，J=8.4 Hz，H-1)，1.95(3H，s，H-13)，1.92(3H，s，H-e)，1.88(1H，m，H-3)，1.86(1H，m，H-5′)，1.86(1H，d，J=4.1 Hz，H-3′)，1.61(1H，d，J=8.6 Hz，H-1′)，1.40(1H，t，J=8.1 Hz，H-3′)，1.34(1H，d，J=3.5 Hz，H-2′β)，1.03(3H，s，H-14)，0.96(1H，t，J=7.4 Hz，H-2α)，0.83(3H，s，H-14′)，0.74(1H，ddd，J=14.5，8.2，3.4 Hz，H-2′α)，0.33(1H，d，J=7.4 Hz，H-2β)。3C-NMR(125 MHz，CDCl3)δppm: 200.7(C-8)，174.5(C-7′)，172.0(C-i)，171.7(C-f)，171.6(C-12′)，170.2(C-12)，167.0(C-a)，147.5(C-11)，142.4(C-4)，135.5(C-c)，132.2(C-5)，131.3(C-7)，129.3(C-b)，123.4(C-11′)，93.3(C-8′)，79.9(C-9)，77.1(C-4′)，72.1(C-15′)，61.6(C-d)，61.3(C-5′)，55.5(C-9′)，54.3(C-13′)，52.4(C-OMe)，51.0(C-10)，45.0(C-10′)，29.2(C-h)，28.7(C-g)，27.8(C-3′)，26.0(C-1)，26.0(C-14′)，25.6(C-1′)，25.4(C-15)，24.8(C-3)，23.4(C-6′)，20.1(C-13)，16.0(C-2)，15.3(C-14)，13.0(C-e)，11.7(C-14)。以上波谱数据与参考文献[12]数据一致，故确定该化合物为银线草醇B(shizukaol B)。

化合物2黄色油状(甲醇)，易溶于三氯甲烷、甲醇、丙酮，C17H20O6，HR-EI-MSm/z: 321.133 6 [M+H]+，641.260 2 [2M+H]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δppm: 4.43(1H，s，H-9)，4.18(2H，m，H-15)，4.13(2H，m，H-13)，2.77(1H，m，H-6α)，2.29(1H，m，H-6β)，2.66(1H，m，H-5)，2.09(3H，s，H-2′)，1.69(1H，m，H-3)，1.61(1H，m，H-4)，1.31(1H，m，H-1)，0.86(1H，m，H-2β)，0.84(1H，m，H-2α)，0.79(3H，s，H-14)。3C-NMR(125 MHz，CDCl3)δppm: 171.2(C-1′)，169.4(C-12)，155.5(C-7)，130.8(C-11)，88.1(C-8)，65.9(C-15)，64.6(C-9)，55.5(C-13)，48.6(C-5)，42.5(C-4)，42.5(C-10)，24.6(C-1)，22.9(C-6)，22.4(C-3)，20.9(C-2′)，16.7(C-2)，16.2(C-14)。以上波谱数据与参考文献[13]数据一致，故确定该化合物为银线草内酯G(shizukanolide G)。

化合物3无色油状(甲醇)，易溶于三氯甲烷、甲醇、丙酮，C17H20O5，HR-EI-MSm/z:305.138 6

[M+H]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δppm: 6.38(1H，s，H-9)，4.44(2H，s，H-13)，4.20(2H，dd，J=6.1，1.1 Hz，H-15)，2.87(1H，dd，J=16.8，3.4 Hz，H-6α)，2.37(1H，m，H-6β)，2.26(1H，m，H-5)，2.09(3H，s，H-1′)，1.75(1H，dtd，J=9.8，6.1，3.8 Hz，H-4)，1.56(1H，dt，J=8.1，3.8 Hz，H-1)，1.31(1H，ddd，J=11.8，8.1，3.8 Hz，H-3)，0.92(3H，s，H-14)，0.86(1H，m，H-2β)，0.84(1H，m，H-2α)。13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δppm: 171.2(C-1′)，170.2(C-12)，150.3(C-8)，149.2(C-7)，124.1(C-11)，123.1(C-9)，65.9(C-15)，60.1(C-5)，55.1(C-13)，42.8(C-4)，41.9(C-10)，27.2(C-1)，22.8(C-6)，22.2(C-3)，20.9(C-14)，20.9(C-2′)，16.9(C-2)。以上波谱数据与参考文献[13]数据一致，故确定该化合物为银线草内酯H(shizukanolide H)。

化合物4白色无定形粉末(三氯甲烷)，易溶于三氯甲烷、甲醇，C29H50O，mp:138～141 ℃，ESI-MSm/z: 438.53 [M+Na+H]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δppm: 5.34(1H，br.s，H-6)，3.52(1H，m，H-3)，2.32～1.03(9H，m)，1.02(3H，s，H-19)，1.00(3H，s，H-18)，0.96(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.89(3H，d，J=6.7 Hz，H-28)，0.85(3H，t，J=6.9 Hz，H-26)，0.81(3H，d，J=6.7 Hz，H-29)。13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δppm: 140.8(C-5)，121.7(C-6)，71.8(C-3)，56.8(C-14)，56.1(C-17)，50.2(C-9)，45.8(C-24)，42.3(C-4)，42.1(C-13)，39.8(C-12)，37.3(C-1)，36.5(C-10)，36.2(C-20)，33.9(C-22)，31.9(C-8)，31.9(C-7)，31.6(C-2)，29.2(C-25)，28.2(C-16)，26.0(C-23)，24.3(C-15)，23.0(C-28)，21.1(C-11)，19.8(C-26)，19.4(C-19)，19.0(C-27)，18.8(C-21)，12.0(C-29)，11.8(C-18)。以上波谱数据与参考文献[14]数据一致，故确定该化合物为β-谷甾醇(β-sitosterol)。

化合物5无定形黄色粉末(三氯甲烷)，易溶于三氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯，C18H18O5，mp:114～116 ℃，HR-ESI-MSm/z: 315.121 9 [M+H]+。1H-NMR (500 MHz， CDCl3)δppm: 7.80 (1H，d，J=15.6 Hz，H-β)，7.77 (1H，d，J=15.6 Hz，H-α)，7.55 (1H， d，J=8.8 Hz，H-2/6)，6.92 (1H，d，J=8.7 Hz，H-3/5)，6.10 (1H，d，J=2.4 Hz，H-3′)， 5.95 (1H，d，J=2.3 Hz，H-5′)，3.90 (3H，s，H-6′OMe)，3.84 (3H，s，H-4OMe)，3.82 (3H，s，H-4′OMe)。13C-NMR (125 MHz，CDCl3)δppm: 192.8 (C=O)，168.4 (C-2′)，166.0 (C-4′)，162.5 (C-6′)，161.4 (C-4)，142.5 (C-β)，130.1 (C-2/6)，128.3 (C-1)，125.4 (C-α)， 114.3 (C-3/5)，106.4 (C-1′)，93.8 (C-3′)，91.2 (C-5′)，55.8 (C-6′OMe)，55.6 (C-4′OMe)，55.4 (C-4OMe)。以上波谱数据与参考文献[15]数据一致，故确定该化合物为卡瓦胡椒素A (flavokawain A)。

4海虾致死活性

配制质量浓度为25.0 g·L-1的人工海水(pH 8.0～8.5)，取适量丰年虾卵放入人工海水中，28 ℃孵化48 h，待用。将测试样品配制成质量浓度为2.0 mg·mL-1的二甲基亚砜 (DMSO) 溶液，用移液枪分别吸取10.0，8.0，6.0，4.0，2.0，1.0和0.5 μL，加入96孔板中，再加入相应的海虾海水溶液 (约15～20只海虾) 使孔中液体达到200 μL，鬼臼毒素和DMSO分别为阳性和空白对照，每一处理重复3次。在28 ℃培养24 h，显微镜下观察，记录海虾死亡数[16]。根据公式计算不同质量浓度下的校正死亡率，采用SPSS软件的Probit模型计算半数致死浓度 (LC50)。

校正死亡率=(T-C)/(1-C)×100%

公式中，T为样品致死率，C为空白对照致死率。

海虾致死活性测试表明，化合物1的LC50值与阳性对照品相当，均小于5 mg·L-1，化合物3的LC50值(48 mg·L-1) 较强于化合物2 (73 mg·L-1)，这可能是由于C-8与C-9间三元氧环还原形成双键，从而导致药效更强。化合物5也具有中等强度的海虾致死活性，其LC50值为52 mg·L-1。

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