5-氨基酮戊酸光动力疗法对痤疮丙酸杆菌体外抑制的实验研究

施建新，闵仲生

（江苏省中医院，南京 210029）

痤疮是一种临床常见毛囊皮脂腺的慢性炎症性疾病，各年龄皆可发病，以青少年发病率为最高。5-氨基酮戊酸光动力疗法（ALA-PDT）是近年来快速发展的一种治疗痤疮的新型方法。本研究参考临床使用ALA 的浓度及孵育时间，旨在研究不同浓度ALA-PDT 对不同浓度痤疮丙酸杆菌(P.acnes)的体外抑制效果。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂 P.acnes 标准菌株（ATCC11827，购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心）；5-氨基酮戊酸（由上海复旦张江生物医药股份有限公司提供）；琼脂（L3027，购自美国Sigma-Aldrich公司）；厌氧产气袋（购自三菱瓦斯化学株式会社）。

1.2 主要仪器 高能窄谱光动力治疗仪[由安徽航天生物科技有限公司提供，采用半导体固态冷光源，波长（640±10）nm，光功率密度2～230 mW/cm2]

1.3 方法

1.3.1 悬液的制备 在微生物限度室，使用涂布接种法复活P.acnes 菌株，肉汤增殖法体外扩增培养，麦氏比浊法测定P.acnes 浓度，调整菌最大浓度为1.7×108CFU/mL（Colony forming units），依次稀释至1.7×107CFU/mL、1.7×106CFU/mL、1.7×105CFU/mL、1.7×104CFU/mL，加入96 孔板中，每种浓度细菌设48 孔，每孔菌液200 μL。

1.3.2 实验分组 实验组：ALA-PDT 组分为5g/L、3.6 g/L、2.5 g/L 等3 组，在96 孔板中加入对应质量的ALA，置于37 ℃培育箱中，避光孵育15 min。

对照组：（a）ALA 组分为5 g/L、3.6 g/L、2.5 g/L 3 组，对应各浓度组96 孔板中加入相应质量的ALA，置于37 ℃培育箱中，避光孵育15 min。（b）细菌红光组。（c）细菌组。

1.3.3 处理方法 将ALA-PDT 组与细菌红光组96 孔板垂直置于光源下20 cm 处，调整光斑直径至10 cm，刚好将96 孔板完全覆盖，测定光功率密度为80 mW/cm2，照射时间15 min。同时ALA 组与细菌组96 孔板仍避光置于37 ℃培育箱中，直至ALA-PDT组与细菌红光组照光结束。

照光结束后，同组每孔吸取100 μL 菌液，均匀混合，最后同组取0.5 mL 均匀混合液，在90 mm 标准培养皿中采用倾注培养法浇板，培养皿置于厌氧培养盒中采用厌氧培养法培养2 d，培育箱设定为37 ℃。

2 d 后，观察各组培养皿中是否有菌落产生，以上实验重复3 次。

2 结果

5 g/L ALA-PDT 组各浓度的培养皿中未见菌落产生，2.5 g/L ALA-PDT 组各浓度的培养皿中可见菌落产生，3.6 g/L ALA-PDT 组除107CFU/mL 浓度组培养皿中可见菌落产生外，其余各浓度细菌组培养皿中未见菌落产生。ALA 组、细菌组、细菌红光组培养皿中均可见菌落产生。见表1。

表1 P.acnes 生长情况

3 讨论

痤疮的发生主要与雄激素与皮脂增加、毛囊皮脂腺过度角化、痤疮丙酸杆菌及继发炎症反应等原因相关。一般认为P.acnes 产生的各类生物酶，能分解三酰甘油，释放具有生物活性的组胺、细胞趋化物质、短链脂肪酸等参与炎症反应，部分分解物也刺激毛囊皮脂腺过度角化。其细胞成分中的肽聚糖可被TLR2 识别，并启动免疫应答[1]，从而加重炎症反应。P.acnes 也可诱导IL-8 的产生及IL-8 mRNA在单核巨噬细胞（THP-1）中积聚，这种诱导与积聚作用与P.acnes 的数量、作用时间存呈正相关[2]。

ALA-PDT 是一种应用特定波长光源照射光敏剂，通过光动力学效应选择破坏病变组织的治疗技术。目前生物合成ALA 的途径有两条[3-4]：（1）C4 途径：由三羧酸循环生成的琥珀酰辅酶A 起始，在某些细菌中，琥珀酰辅酶A 是由丙酰辅酶A 通过甲基丙二酰辅酶A 途径得到；（2）C5 途径：由谷氨酸起始合成ALA。细菌和藻类中的ALA 主要通过C5 途径合成，而厌氧光合细菌则通过C4 途径合成ALA。光合细菌在细胞内即可合成出ALA, 并在相关胞内酶的作用下，ALA 进一步转化为尿卟啉、粪卟啉，直至原卟啉（PpⅨ）。体外研究表明，P.acnes 不需要任何外界的刺激，即可产生尿卟啉与粪卟啉[5]，另外本实验结果表明5.0 g/L ALA-PDT 组与部分3.6 g/L ALA-PDT 组P.acnes 生长被抑制，所以推测P.acnes细胞内应存在某些酶可将外源性ALA 转化为粪卟啉与尿卟啉，或许甚至可以合成PpⅨ。因为ALA 是小分子水溶性化合物，所以可以顺利透过细菌的细胞膜，进入细菌体内，但国内外至今还未见外源性ALA 进入P.acnes 体内方式相关理论与实验研究的报道。本实验照光后P.acnes 生长被抑制，这与其他革兰阳性菌与革兰阴性菌光动力实验结果一致[6]。电镜下可观察到K+从细胞内外排增多并导致一种磷酸盐显著丢失的现象, 以上的现象可以解释为细菌细胞膜损伤的结果，尤其是上述现象可能影响了细胞膜上的离子泵, 另外照光产生的自由基可能改变细胞膜正常的链接或者改变细胞膜的结构，从而减少细胞内的K+、破坏ATP 酶活性及诱导痤疮丙酸杆菌死亡[5]。

国内学者研究发现，11~15 岁年龄组中，无痤疮者未发现P.acnes，而痤疮患者中本菌数量为114 800/cm2；16～20 岁年龄组也有同样的差别，老年人本菌的数量近似有或无痤疮患者[7]。目前公认光动力治疗的3 个基本要素是光敏剂、光源及氧，但影响光动力效果的因素却又有很多种，例如孵化时间、光照强度等。国外研究者发现[8]，正午晴空室外太阳的光功率密度约为60 mW/cm2，其中可见光功率密度约为22.2 mW/cm2，其余为紫外与红外辐射。另外光功率密度大于40 mW/cm2时，才能满足光生物化学效应阈值，产生光生物调节作用，所以本实验选择80 mW/cm2,既产生生物学效应，又高于自然光线，可供临床设定光功率密度时作参考。本实验中ALA组、细菌组、细菌红光组做相应处理后，P.acnes 仍旧生长，因为它们不能同时具备光敏剂、光源及氧这3个基本的要素，所以不能引发光动力生物化学作用。

笔者发现ALA 浓度达到3.6g/L 及以上，与P.acnes共同孵育15 min 后采用红光照射15 min，可完全抑制P.acnes 的生长。按照本实验对痤疮丙酸杆菌体外抑制的研究，可为临床ALA-PDT 治疗痤疮提供参考。

[1] Tian LM,Xie HF,Yang T,et al.Association study of tumor necrosis factor receptor type 2 M196R and toll-like receptor 2 Arg753Gln polymorphisms with acne vulgaris in a Chinese Han ethnic group[J].Dermatology,2010,221:276-284.

[2] Chen QJ, Koga T, Uchi H, et al. Propionibacterium acnes-induced IL-8 production may be mediated by NF-κB activation in human monocytes[J].J Dermatol Sci,2002,29:97-103.

[3] Sch觟n A, Krupp G, Gough S, et al. The RNA required in the first step of chlorophyll biosynthesis is a chloroplast glutamate tRNA[J].Nature,1986,322:281-284.

[4] Burnham BF.δ-Aminolevulinic acid synthase（Rhodopseudomonas sphaeroides）[J].Methods Enzymol,1970,17:195-204.

[5] Ashkenazi H, Malik Z, Harth Y, et al. Eradication of Propionibacterium acnes by its endogenic porphyrins after illumination with high intensity blue light[J]. FEMS Immunol Med Microbiol,2003,35:17-24.

[6] Nitzan Y, Salmon-Divon M, Shporen E, et al. ALA induced photodynamic effects on gram positive and negative bacteria[J].Photochem Photobiol Sci,2004,3:430-435.

[7] 丁松.皮肤医学[M].北京：中国医药科技出版社，1997:287.

[8] Zeina B, Greenman J, Purcell WM, et al. Killing of cutaneous microbial species by photodynamic therapy[J].Br J Dermatol,2001,144:274-278.