噬菌体法对老年复治肺结核合并糖尿病患者抗结核药物耐药分析

高绪胜 丁彩红 熊瑜

噬菌体法对老年复治肺结核合并糖尿病患者抗结核药物耐药分析

高绪胜 丁彩红 熊瑜

目的 探讨噬菌体检测法（PhaB）快速检测老年复治肺结核合并糖尿病患者结核分支杆菌对异烟肼（H）、利福平（R）、乙胺丁醇（E）和链霉素（S）4种一线抗结核药物的耐药性，分析其临床应用价值。 方法 应用PhaB法检测65例老年复治肺结核合并糖尿病患者结核分枝杆菌对4种一线抗结核药物的耐药性。

噬菌体扩增法；复治肺结核；糖尿病；耐药；老年人

近年来老年结核病患者人数在全球呈相对上升趋势，病死率较高［1］，老年人体质差，免疫力低，合并症多，对抗结核药物耐受性差等，造成耐药尤其是耐多药病例较多。且近30年来，糖尿病患病率显著增加，流行病学研究显示≥60岁人群的患病率为20.4%［2］。糖尿病合并肺结核发病率亦呈上升趋势，糖尿病患者中肺结核的发生率是正常人的4～8倍，有报道10%～30%的肺结核患者患有糖尿病［3］。结核病可加重糖尿病，血糖控制欠佳又可使结核病加重，两者互为因果，造成恶性循环，加之耐药，使治疗更加困难。噬菌体检测法（PhaB）检测结核分枝杆菌耐药性具有快速、简便、价廉等特点［4］。本研究利用PhaB法检测老年复治肺结核及合并糖尿病患者对一线抗结核药物异烟肼（H）、利福平（R）、乙胺丁醇（E）和链霉素（S）的耐药情况，分析其耐药性，为临床治疗提供参考，现将结果报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

1.1.1 标本来源：患者来源于2011年3月至2014年12月在山东省胸科医院结核科收住院的采用改良罗氏培养基培养法行痰培养阳性的鉴定为结核分枝杆菌的老年复治肺结核患者65例，年龄60～91岁，中位年龄69岁。

1.1.2 诊断标准：按2000年中华医学会结核病学分会制定的《肺结核诊断和治疗指南》［5］，有下列情况之一者定义为复治：（1）初治失败的患者；（2）规则用药满疗程后痰菌又复阳的患者；（3）不规律化疗＞1月的患者；（4）慢性排菌患者。耐药肺结核是指耐≥1种抗结核药物的肺结核。单耐药定义为结核病患者感染的结核分枝杆菌在体外被证实对1种抗结核药物耐药；多耐药定义为对＞1种抗结核药物耐药，但不包括同时耐异烟肼和利福平；耐多药：对至少包括异烟肼和利福平≥2种药物产生耐药的肺结核病患者。

糖尿病诊断标准按WHO1999年颁布的《糖尿病诊断标准》［6］。

1.1.3 患者纳入和排除标准：纳入标准：（1）符合上述复治肺结核及复治肺结核合并糖尿病诊断标准；（2）年龄≥60岁。排除标准：（1）痰结核菌培养阴性患者；（2）非结核分枝杆菌患者；（3）合并HIV、乙肝并发症患者；（4）年龄＜60岁。

1.1.4 试验材料：参考噬菌体为分枝杆菌噬菌体D29，购自上海金浩公司，为英国BIOTEC Lab公司产品；分枝杆菌噬菌体按照文献进行培养、增殖［4］，保存备用。结核分枝杆菌标准菌株（H37Rv）购自国家菌种保藏中心。液体培养基Middlebrook 7H9培养基干粉（美国Difico公司产品）购自BD公司；指示细胞为快速生长的耻垢分枝杆菌（ATCC607，购自卫生部结核病控制中心）。杀毒剂：硫酸亚铁胺为Sigma公司产品；链霉素、异烟肼药粉购于Sigma公司，利福平、乙胺丁醇药粉为上海信谊药厂产品。

1.2 试验方法

1.2.1 标本的处理：65株老年复治肺结核患者临床分离株，经鉴定为结核分枝杆菌（检测前将待检菌株转种至罗氏培养基，37℃培养2周）。检测时刮取菌落少许，磨菌后用液体培养基调整浊度至1个麦氏单位，1∶5000稀释后待检。

1.2.2 PhaB法检测耐药性：应用PhaB法检测65例痰培养阳性的结核分枝杆菌临床分离株对H、R、E、S 4种一线抗结核药物耐药性。具体操作步骤按照文献进行［4］。在对照管和试验管中分别加入1∶5000稀释的待检菌液0.5 m l，分别在试验管中加入0.5 m l的H、R、E、S，对照管加0.5 m l液体培养基，混匀37℃作用48 h，每次检测时设杀毒剂硫酸亚铁铵对照管以及液体培养基阴性、耻垢分枝杆菌对照管。分别计算每个菌株的加药管与对照管的噬菌斑减少百分比。以加药管与对照管的噬菌斑减少百分比≥99%判为敏感，反之为耐药；异烟肼以加药管与对照管的噬菌斑减少百分比＞95%判为敏感，反之为耐药。

1.3 统计学分析 2人同时采用Excel表格进行录入数据，核对无误后应用SPSS 16.0进行数据统计学处理，计数资料采用率（%）表示，2组差异性比较采用χ2检验，以P＜0.05认为差异有统计学意义；应用95%可信区间（95%CI）估计总体参数范围。

2 结果

2.1 一般资料 65例患者中，年龄60～91岁，平均（70.30±8.17）岁，男 53例，女 12例，男女比例为4.12∶1。其中单纯老年复治肺结核43例，男36例，女7例，平均年龄（69.42±8.01）岁；合并糖尿病22例，男17例，女5例，平均年龄（71.29±8.54）岁。2组性别、年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 总耐药情况 65例老年复治肺结核患者结核分枝杆菌对4种一线抗结核药物总耐药率为40.00% （26/65），其中单纯老年复治肺结核组耐药率为34.88%（15/43），合并糖尿病组耐药率为 50.00% （11/22），2组间耐药率差异无统计学意义（χ2=1.39，P=0.24）。见表1。老年复治肺结核合并糖尿病组耐多药率、耐S率均高于单纯老年复治肺结核组（χ2= 5.25，P=0.02；χ2=5.24，P=0.02）。见表2。

2.3 不同血糖水平对耐药性影响 空腹血糖≥7.10 mmol/L者较空腹血糖＜7.10 mmol/L者耐药率高，2组之间差异有统计学意义。见表3。

表1　2组耐药情况（n，%）

表2　2组耐药情况比较（n，%）

表3　不同血糖水平耐药情况比较（n，%）

3 讨论

研究结果显示我院结核科痰培养阳性的住院老年复治肺结核患者对H、R、E、S 4种一线抗结核药物总耐药率为40.00%，单耐药率为15.38%，多耐药率为7.69%，耐多药率为16.92%，总耐药、单耐药及多耐药率低于我国2007～2008年全国结核病耐药性基线调查报告中老年复治肺结核总耐药率46.39%、单耐药率22.41%、多耐药率8.34%；耐多药率高于2007～2008年全国结核病耐药性基线调查报告的15.63%［7］。2007～2008年全国结核病耐药性基线调查耐药率为上述4种药物加卡那霉素和氧氟沙星6种抗结核药物，此次统计HRES 4种抗结核药物耐药性，耐药率较高，尤其是耐多药情况比较严重。

本研究显示老年复治肺结核合并糖尿病组耐药率高于单纯老年复治肺结核组，其中耐多药及S率差异有统计学差异。空腹血糖≥7.1 mmol/L组耐药率高于空腹血糖＜7.1 mmol/L组，差异有统计学意义。Duangrithi等［8］研究发现肺结核合并糖尿病患者耐H、R、吡嗪酰胺率稍高于单纯肺结核患者，但均无统计学差异。熊瑜等［9-10］、高绪胜等［11］研究发现肺结核合并糖尿病组耐药率稍高于单纯肺结核组，差异无统计学意义。分析原因考虑：（1）糖尿病患者肺泡上皮细胞增厚，肺毛细血管基底膜增厚、肺弹性下降导致肺容量下降、弥散功能及顺应性低下等，以及自主神经病变可导致气道反应性、支气管扩张性下降，从而易于感染肺结核。（2）糖尿病患者由于肝脏转化维生素A机能降低，导致维生素A缺乏，使呼吸道黏膜上皮对外界抵抗力下降，易被结核菌感染［3］。（3）糖尿病患者常有糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱，导致机体的免疫功能减退，有报道血糖＞12 mmol/L患者较血糖＜12 mmol/L者巨噬细胞吞噬指数显著降低［12］。随着血糖升高，免疫功能降低，尤其是老年糖尿病患者体抗力差，CD4/CD8较非糖尿病患者更低［13］。免疫功能降低可能易于结核分枝杆菌尤其耐药菌的感染。（4）研究证实糖尿病和肺结核患者均存在易感基因［14］，两者并存还可能造成或促进结核分枝杆菌耐药基因的突变；胆固醇被确认为结核分枝杆菌存活、感染的重要营养素，丙酮酸也有促进结核分枝杆菌生长作用，尤其是老年糖尿病患者，血糖控制欠佳，体内葡萄糖大量堆积，脂肪分解，三酰甘油增多，为结核分枝杆菌包括耐药菌提供了一个良好的生存及繁殖环境，使得结核分枝杆菌快速繁殖，且由于菌量大，易产生耐药变异菌。有报道菌群越大，耐药菌存在的概率越高。老年肺结核合并糖尿病患者病情重，病灶以干酪性为主，且多伴有空洞形成，且结核菌容易形成耐药菌［15］。糖尿病患者病程在5～10年者，易并发多脏器病变，尤其是老年患者并发症更多，如肝肾功能障碍，对抗结核药物耐受性较中青年差，限制抗结核药物的正常使用，影响抗结核效果，使结核病变迁延、难治、耐药增加。

综上所述，老年复治肺结核合并糖尿病患者耐药率之高不容忽视，应用PhaB法检测结核分枝杆菌的耐药性简单、快速，大大缩短结核分枝杆菌耐药性检出周期，根据结果及时调整用药方案，为临床治疗提供参考。但此次PhaB法检测药敏试验药物仅限于4种一线抗结核药物，有待增加其他一线和二线抗结核药物药敏试验进一步完善。本研究发现老年复治肺结核合并糖尿病患者耐药率高于单纯复治肺结核患者耐药率，尤其是耐多药率及耐S率；血糖控制差，耐药率高，故应积极控制血糖，合理制定化疗方案。由于本研究的样本量有限，有待于扩大样本进一步研究。

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Analysis of the drug resistance in the elderly patientsw ith retreatment tuberculosis com plicated with diabetes using phage biological amp lification

GAO Xu-sheng，DINGCai-hong，XIONGYu.Department ofTuberculosis，Shandong Provincial Chest Hospital，Jinan 250013，China

Objective To explore the drug resistance of mycobacterium tuberculosis to the four first-line anti-TB drugs，including isoniazid（H），rifampicin（R）and ethambutol（E），streptomycin（S），in the elderly patients with retreatment tuberculosis complicated with diabetes，by using phage biological amplification（PhaB）. Methods PhaB was used to detect the drug resistance of the mycobacterium tuberculosis to the four first-line anti-TB drugs in 65 elderly cases of retreatment tuberculosis complicated with diabetes. Results The total drug resistance rate of the elderly patients with retreatment of pulmonary tuberculosis complicated with diabeteswas 50.00%，compared with 34.88%in the elderly patients retreatment pulmonary tuberculosis without diabetes（χ2=1.39，P=0.24）；There were significant differences inmulti-drug resistance ratio and streptomycin resistance between two groups（χ2=5.25，P=0.02；χ2=5.24，P= 0.02）.The resistant rate was 69.23%in the elderly patients with retreatment pulmonary tuberculosis with a blood glucose level≥7.10mmol/L，compared with 22.22%in the patients with a blood glucose level less than 7.10mmol/L（χ2=4.70，P=0.03）. Conclusions Multi-drug resistance ratio and streptomycin resistance is high in the elderly patients with retreatment pulmonary tuberculosis，especially in the patientswith a blood glucose level≥7.10mmol/L.PhaB method can rapidly detect the drug resistance ofmycobacterium tuberculosis，and can guide the clinicalmedication.

phage biological amplification；retreatment tuberculosis；diabetes；drug resistance；aged

R 521

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.12.016

2015-06-10）

山东省医药卫生科技发展计划项目（2013WS0146）

250013山东省济南市，山东省胸科医院结核内科

丁彩红，Email：dingdding_64@163.com

结果 老年复治肺结核合并糖尿病患者总耐药率为50.00%，单纯老年复治肺结核患者的总耐药率为34.88%，2组差异无统计学意义（χ2=1.39，P=0.24）；2组耐多药率和耐S率差异有统计学意义（χ2=5.25，P= 0.02；χ2=5.24，P=0.02）。老年复治肺结核合并糖尿病患者空腹血糖≥7.10 mmol/L组耐药率为69.23%，高于空腹血糖＜7.1mmol/L组的22.22%，2组差异有统计学意义（χ2=4.70，P=0.03）。 结论 老年复治肺结核合并糖尿病患者耐多药率和耐S率高，尤其是血糖≥7.10 mmol/L者。PhaB法能快速检测结核分枝杆菌耐药性，指导临床用药。