缺氧和酸中毒对成骨细胞功能影响研究进展

任原，王茜，李琪佳，王志强

1.河北联合大学附属医院骨科，河北唐山 063000；2.河北联合大学基础医学院人体解剖系，河北唐山 063000；3河北联合大学实验中心，河北唐山 063000

缺氧和酸中毒对成骨细胞功能影响研究进展

任原1，王茜2，李琪佳3，王志强1

1.河北联合大学附属医院骨科，河北唐山 063000；2.河北联合大学基础医学院人体解剖系，河北唐山 063000；3河北联合大学实验中心，河北唐山 063000

局部pH值和氧分压（pO2）的变化可影响成骨细胞功能。成骨细胞对pH值直接影响极其敏感：酸中毒抑制成骨细胞的矿物沉积。成骨细胞对小范围pH变化反应机制较复杂，涉及对细胞膜离子通道、受体以及细胞内的直接影响。研究表明缺氧严重抑制成骨细胞的生长和分化，促进成骨细胞凋亡。在体内，由于血管灌注的减少和糖酵解代谢的增加，组织缺氧通常伴有酸中毒。血液供应的中断，使成骨细胞pO2减少和pH值降低，而对成骨细胞活动产生负面影响。该文就缺氧和酸中毒对成骨细胞的功能影响及近年研究进展作一综述。

缺氧；酸中毒；成骨细胞

体内氧含量和酸碱平衡是机体或细胞维持正常功能所必需。骨损伤发生时损伤部位血流减少或中断，氧分压降低。严重缺氧时损伤部位糖代谢不完全，无氧酵解增强，酸性产物增多导致酸碱平衡紊乱甚至引起酸中毒。缺氧和酸中毒会引起骨代谢的改变，导致骨质丢失，影响骨损伤愈合。该综述就近年来关于缺氧和酸中毒对成骨细胞功能影响做一介绍。

1 氧分压和成骨细胞

1.1 缺氧的因素

发生缺氧时组织血液供应减少或阻断。动脉血氧张力（pO2）为95mmHg(12%)；静脉血和毛细血管血液的氧张力（pO2）为40mmHg（5%），约为大气氧张力的1/4。在正常组织中，组织缝隙中pO2范围为3%～9%。从正常的志愿捐赠者的吸出的骨髓测量取得的pO2平均值为6.6%[1]。由于血流中断而导致组织灌注减少的潜在原因有很多并且许多合并骨质疏松，包括老化、炎症、感染、骨折，去载、肿瘤、糖尿病、吸烟/尼古丁和糖皮质激素。阻塞性肺疾病和贫血可导致慢性低氧血症（动脉氧缺乏），同样与骨质疏松密切相关。细胞氧浓度一般保持在较小的生理范围。缺氧会导致不能产生足够ATP维持细胞基本功能[2]，而富氧可能会导致破坏活性氧中间体产生。细胞通过缺氧诱导转录因子（HIF）氧依赖性降解对O2反应，HIF是一种含α和β亚基的异源二聚体。有氧条件下HIF-1α和与之密切相关的因子HIF-2α是脯氨酰羟化酶族的靶向，利用氧分子和2-同戊二酸（需要抗坏血酸作为辅助因子）选择性地羟化两个脯氨酸残基[3]。这些羟脯氨酸残基被Von Hippel Lindau肿瘤抑制蛋白（pVHL）识别，pVHL启动HIF-α多聚泛素化，利用蛋白体酶靶向性降解。在供氧不足时脯氨基羟化酶无活性，HIF-α的脯氨酸残基没有变化；HIF-α保持稳定且能与其转录伴侣HIF-β异源二聚体化。HIF异二聚体结合缺氧反应元件（HRES），在靶基因启动子序列和启动转录的缺氧调节基因中参与多种细胞活动，包括血管生成（其中VEGF为重要因子）、能量代谢、细胞增殖/生存和pH调控[4]。

1.2 缺氧对成骨细胞功能的影响

体外培养成骨细胞对缺氧反应较复杂，其中血管内皮生长因子（VEGF）[5]、成骨细胞转录因子Runx2/Cbfa1[6]、胰岛素样生长因子Ⅱ和转化生长因子β1[7]表达减少；ATP释放表达增加（抑制矿化并且刺激破骨细胞）。缺氧对骨髓间充质干细胞的影响包括刺激成纤维细胞增殖，增加骨生成的潜能，刺激脂肪细胞[8]。即使缺氧会抑制这些活动，体外培养成熟成骨细胞短暂暴露于1%O2并不影响骨结节形成和Runx2表达。研究表明，短期缺氧可促进成骨细胞生长，但长期缺氧可抑制成骨细胞生长、分化和骨形成能力，因此随着缺氧时间延长，成骨细胞增值能力下降，由它表达的RANKL、骨保护素（osteoprotegerin OPG）也随着缺氧时间延长表达相对减弱[9-10]。慢性缺氧对取自新生大鼠颅盖骨成骨细胞功能有影响。缺氧抑制骨细胞生成由于成骨细胞生长和分化减少/延迟对细胞增殖、碱性磷酸酶表达的胶原蛋白产生都有明显的抑制作用[11]。氧气浓度降低至20%逐渐抑制骨形成，直至氧分压接近2%时骨形成完全抑制。缺氧下抑制某些胶原蛋白产生可能由于氧依赖酶、脯氨酰羟化酶和赖氨酰氧化酶活性降低，胶原蛋白分子翻译后修饰需要这些酶参与，而这些关键酶的表达在缺氧下也减少。氧依赖脯氨酰羟化酶族作用于HIF-A，胶原脯氨酸羟化酶是其中一种。缺氧不会造成成骨细胞死亡增加，而是引起一种可逆静止状态[12]。体内骨形成通常发生在动脉血和静脉血氧分压分别为12%和5%的环境中。因此大气中氧浓度 （实验控制至20%）实际上是为高氧状态。在氧浓度生理范围时（5%～12%O2）成骨细胞骨形成约为氧气浓度为20%时成骨细胞骨形成的50%。成骨细胞对氧气敏感性可能有助于解释已知的依赖性骨形成和依赖性血管再生。因此缺氧可抑制成骨细胞生长和骨形成并促进凋亡。

相关骨骼稳态中血管和氧分压的研究可能会改进对于影响骨骼的治疗作用机制。Chang等[13]发现缺氧能够使成骨细胞产生与骨关节炎表型相同的病理改变，表明缺氧是骨关节炎病理的关键因素。研究表明通过操控氧气传感分子机制来提高骨再生是可行的。小鼠成骨细胞缺乏HIF-1α表现为骨发育受损；相反，HIF-1α通路的激活可增加骨形成，促进成骨塑形中依赖VEGF的股血管分布和再生。

2 酸碱平衡和成骨细胞

2.1 酸中毒的成因

细胞普遍对H+浓度的变化非常敏感，血液和细胞外液pH值时刻保持精密的调节。血液pH值主要通过CO2/HCO3-缓冲系统和血红蛋白中组氨酸残基的调节。如果肺部不能足够地将体内产生的CO2排出，血液中的H+浓度增加（即pH值降低）时，体内的HCO3-浓度相对不变，称为呼吸性酸中毒。相反，H+（例如作为代谢产物的含硫、氮、磷的相关分子）会降低血液pH值和减少HCO3-水平，而CO2浓度没有显著改变。以此方式产生的质子，与相关代谢产生的阴离子必须经由肾脏排除体外；如果没有足够的H+排出就会出现代谢性酸中毒[14]。除肾功能和呼吸系统疾病外，还有很多导致酸中毒潜在因素且多与骨质疏松相关，包括无氧运动、胃肠炎、蛋白质或氯化物过度消耗、糖尿病、老化、更年期或雄性激素缺乏。酸中毒可导致局部由于缺血[15]、缺氧[16]、炎症[17]、肿瘤[18]等。激素、生长因子或细胞因子刺激细胞代谢也可导致细胞外酸化，例如甲状旁腺激素和胰岛素样生长因子（IGF-1）可使成骨细胞迅速分泌酸性物质[19]。虽然动脉血pH值通常接近7.40，静脉血pH值接近7.36，但组织中细胞间液的pH值通常更低并且有着复杂的浓度梯度，这取决于细胞的代谢活动与最近毛细血管之间的距离和微血管系统质量。

2.2 酸中毒对成骨细胞增殖分化的影响

Frick等[20]首次研究pH值对成骨细胞的影响,指出轻度代谢性酸中毒可选择性减少细胞外基质基因表达，包括体外培养小鼠成骨细胞胶原蛋白。pH值7.4时成骨细胞形成丰富的类似骨小梁矿化结构，酸化后矿化逐渐减少并在pH值6.9时完全消除，胶原小梁结构在低pH值下仍然明显存在。很显然，pH值7.4～6.9时成骨细胞增殖、胶原蛋白合成不受影响，酸化对胶原蛋白超微结构和组织结构没有影响。然而pH值在7.4左右时成骨细胞碱性磷酸酶活性最高，pH值降低至6.9时活性降低8倍，同时导致碱性磷酸酶mRNA表达下调，而基质Gla蛋白 （一种矿化抑制剂）mRNA上调。在相同pH值降低时，羟基磷灰石中CA2+和PO43-溶解度分别增加2倍和4倍。另一种可能是稳定低水平骨细胞代谢产酸抑制了原位被动矿化（矿化凋亡）。结果表明酸中毒可选择性抑制基质矿化[10]。Kato等[21]研究表明许多疾病导致的体内酸中毒抑制成骨细胞的生长和分化，其中TRP信号通路可能是导致酸敏感的机制。因此酸中毒未纠正时成骨细胞的碱性矿物质沉积减少。成骨细胞还表达多种酸敏感离子通道,例如成骨细胞表达的ASICs1-3和ATP受体P2X2；成骨细胞样细胞系表达的TRPV4和TRPM8。Subrahmanyam等[22]的研究结果表明代谢酸中毒影响骨代谢平衡并导致相关骨疾病。

2.3 总结与展望

顾九君[23]等研究证实缺氧具有抑制成骨细胞增殖、分化及下调大鼠成骨细胞中Ⅰ型胶原α1、骨钙素基因表达的作用，引起股息形成与骨吸收失衡，最终造成骨密度的降低，导致骨质疏松的发生。吴雁等[24]发现促红细胞生成素具有抗凋亡、抗炎、抗氧化和促血管生成作用，对骨组织损伤和骨科手术有可观的价值和医疗前景。肿瘤转移和骨细胞的互相作用作为一个明显过程，酸中毒和缺氧可能是重要因素。组织缺氧造成血管灌注减少和糖酵解代谢增加，通常伴有酸中毒。缺氧和酸中毒直接作用于骨细胞，因此血液供应的中断对骨骼产生很多负面影响。缺氧和酸中毒时成骨细胞呈现功能缺失，而破骨细胞呈现显著的功能获得。骨细胞在缺氧和酸中毒的反应也与正常老化时骨形态发生的变化相一致。这些相关功能性改变对一系列骨疾病和正常骨生理学提供了新的见解。

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Recent Advances in Effects of Hypoxia and Acidosis on the Proliferation and Differentiation of Osteoblast

REN Yuan1,WANG Qian2,LiQi-jia3,Wang Zhi-qiang1
1.Departmentof Orthopaedics,Affiliated Hospital of Hebei United University,Tangshan,Hebei Province,063000 China；2.Department of Anatomy,Basic Medical College of Hebei United University,Tangshan,Hebei Province,063000 China；3.Experimental Center,Hebei United University,Tangshan,Hebei Province,063000 China

The function of osteoblast is affected by local pH and oxygen tension.Osteoblasts are extremely sensitive to the direct effects of pH:acidosis inhibitsmineral deposition by osteoblasts.Themechanisms by which osteoblasts sense small pH changes are complex,involving in channels,receptors in the cellmembrane and the direct intracellular effects.Reseach shows that severe hypoxia inhibits osteoblast growth and differention,and promotes the apoptosis of osteoblasts.In vivo,tissue hypoxia usually accompanied by acidosis due to reduced perfusion and increased glycolyticmetabolism.Disruption of the blood supply can engender negative effects on osteoblasts via the direct actions of reduced pO2and pH on osteoblasts.This article aims to review recent research progresswhich the effects of hypoxia and acidosis on proliferation and differentiation of osteoblast function.

Hypoxia;Acidosis;Osteoblast

R68

A

1674-0742（2015）07（b）－0195-04

2015-04-05）

国家科技部科技支撑课题（2012BAE06B03）。

任原 （1988-），男，河北唐山人，硕士生，主要从事骨组织工程研究。

王志强（1962.10-），男，河北唐山人，本科，教授，主要研究创伤外科、人工关节翻修及骨移植替代材料方向。