粉尘螨第24组过敏原cDNA克隆表达及其免疫学特性的研究

邱聪龄，钟小军，黄 毅，刘晓宇，蔡泽浪，刘志刚，吉坤美

2.深圳市过敏反应与免疫学重点实验室，深圳 518060

3.深圳大学第一附属医院，深圳 518060

尘螨（dust mite）是导致过敏性疾病的最重要的室内过敏原，可诱发I型变态反应，与过敏性哮喘、过敏性鼻炎及过敏性湿疹等疾病有密切的关系[1]。我国目前有500万以上的儿童患有过敏性哮喘、5 000万以上过敏性鼻炎患者和3 000万以上过敏性皮炎患者，且发病率和死亡率仍呈上升趋势[1]。主要致敏的尘螨物种有屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus，Der p）和粉尘螨（Dermatophagoides farina，Der f），两者过敏原成分高度同源。我国华南地区粉尘螨为室内优势致敏螨种[1]。

本课题组采用第2代高通量测序技术解析了粉尘螨基因组和转录组，并结合蛋白质组技术首次发现了粉尘螨新过敏原组分—细胞色素C还原酶结合蛋白（Ubiquinol－cytochrome c reductase binding protein，UQCRB）的同源物[2]。这一研究成果被世界卫生组织与国际免疫联合会下属的过敏原国际命名委员会正式命名为Der f24。

迄今为止，已经从尘螨中分离鉴定并正式命名了24组过敏原组分。其中，尘螨第一组和第二组过敏原（如Der p1、Der p2）是目前公认的最主要的过敏原成分[3]；对第一组和第二组尘螨过敏原致敏机制研究也相对清楚，其他成分致敏机制尚不明确；Der p1可通过激活蛋白酶受体、抑制树突状细胞分泌IL－12等 途 径 诱 导 Th2 型 免 疫 反 应[3－4]；Der p2作为模拟配体与TLR 4结合而引起Th2型免疫反应[5]。本课题组发现了第24组尘螨过敏原Der f 24，目前尚无这一生化功能类型的蛋白质作为过敏原的研究报道。本研究主要是克隆表达粉尘螨第24组过敏原cDNA，并对其免疫学特性进行初步的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与材料 粉尘螨cDNA文库、大肠杆菌菌株E.coliBL21（DE3）plysS、表达载体pET－His由深圳大学过敏反应与免疫学研究所保存。粉尘螨Der f24表位肽由苏州强耀公司合成。质粒提取试剂、琼脂糖凝胶DNA回收试剂、DNA Marker、LA Taq DNA聚合酶、BamH I及HindIII、T4DNA ligase购自大连宝生物公司，蛋白分子量Marker购自Thermo公司，Ni2＋－Chelating Sepharose购自GE公司。Biotin偶联鼠抗人IgE单抗购自Southern Biotechnology公司。其余试剂均为国产或进口分析纯试剂。

1.1.2 血清标本 粉尘螨过敏患者阳性血清32例，男18例，女14例，年龄21～76岁；健康对照血清标本22例，男12例，女10例，年龄22～69岁。血清经UniCAP Phadia 100过敏原自动检测仪检测，阳性血清对粉尘螨特异性IgE反应达3级或3级以上，阴性血清对粉尘螨特异性IgE反应为0级。血清来自广州医学院第一附属医院，相关临床实验获得该医院伦理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增Der f24cDNA及其克隆与鉴定

以粉尘螨cDNA文库为模板，根据GenBank提供的Der f24基因序列数据（Accession No.KC669700）设计特异性引物，采用套式PCR技术，上游外引物序列为5′－CTTGTGTATATCACGCTCAG－3′上游内引物序列为 5′－GGATCCATGGTTCATCTTACAAAAACTC－3′，下游外引物序列为5′－CTTGTGTATATCACGCTCAG－3′，下 游 内 引物 序 列 为 5′－AAGCTTTCAATCTTTCGACAAGAAAT－3′。其 中 一 对 内 引 物 分 别 加 入BamHI及HindIII的酶切位点。PCR反应参数为：94。C预变性5min，94。C30s，55。C30s，72。C30s，最后72。C延伸10min。将扩增产物回收克隆到pMD18－T载体后进行DNA序列分析。

1.2.2 pET－His－Derf24重组表达质粒的构建与原核表达 将Derf24cDNA质粒双酶切BamH I／HindIII后电泳回收目的基因，克隆至原核表达载体pET－His，构建表达质粒pET－His－Derf24，经测序鉴定正确后转化到大肠杆菌E.coliBL21（DE3）plysS感受态中，挑选抗氨苄青霉素（Amp）阳性菌落，在200mL LB液体培养基 （0.1mg／mL Amp，0.2%D－Glucose）中，37。C180r／min待细菌生长处于对数生长期（A600nm约0.6）时，加入终浓度为1mmol／L的IPTG，37。C180rpm诱导蛋白表达。3h后4。C10 000r／min 5min离心收集菌体。以10ml每克湿菌体的比例加入适量缓冲液（pH8.0），充分混匀；加入适量溶菌酶，冰浴搅拌溶解30min。冰浴超声波破碎细菌：400W，超声3s，停5s，共20个循环，重复3次。4。C13 000r／min离心20min，收集上清及沉淀小样SDS－PAGE电泳检测表达情况。

1.2.3 包涵体的洗涤、变性、纯化及复性 将分离的包涵体，以1∶20（w／v）比例加入预冷的包涵体洗涤溶 液 （1.5mol／L Urea，50mmol／L Tris，100 mmol／L NaCl，5mmol／L EDTA，0.2% （v／v）TritonX－100，pH8.0）充分混匀；4。C，13 000r／min，离心20min，弃上清；沉淀以1：20（w／v）比例加入变性 溶 液 （6mol／L Guanidine Hydrochloride，100 mmol／L Tris，pH8.0），室温下搅拌溶解3h；4。C，13 000r／min，离心30min；将上清上样于已平衡Ni2＋－Chelating Sepharose层析柱（平衡缓冲液含6 mol／L Urea），待上样完毕后用缓冲液（含6mol／L Urea）清洗，直至UV检测（280nm）曲线水平；再用洗 脱 液 （6mol／L Urea，100mmol／L Tris，150 mmol／L NaCl，250mmol／L Imidazole，pH8.0）洗脱目的蛋白，收集目的蛋白。用梯度透析法进行复性，由于该蛋白不含半胱氨酸，无需添加还原剂。

1.2.4 Western blotting检测rDerf 24与尘螨过敏患者特异性IgE反应性 将上述纯化的重组Der f24进行SDS－PAGE电泳，经胶湿法转至NC膜后进行Western blot分析。其中，一抗为粉尘螨过敏患者的血清，同时设健康对照组；二抗为生物素偶联的鼠抗人IgE单抗，DAB显色。其余按照Western blotting常规方法进行。

1.2.5 Der f 24 3D结构模拟及潜在表位肽的合成利用在线软件Swiss－Model软件，参考模板为PDB 1PP9.F，模拟Der f24蛋白的3D结构，并通过DNAStar软件分析其潜在的B细胞表位，选择其中3个肽段人工合成，分别为：表位1位于75－88位氨基酸；表位2位于44－57位氨基酸；表位3位于104－117位氨基酸。合成肽N端为Cys，SH基团用于偶联到BSA上，合成肽经质谱和HPLC分析，由苏州强耀公司完成。

1.2.6 IgE－ELISA试验及其统计分析 用碳酸盐缓冲液（pH9.0）将重组Derf24和合成肽4。C包被过夜；用含5%BSA的PBS溶液37。C封闭2h；按照1∶10的比例稀释粉尘螨过敏患者血清及阴性对照血清37。C孵育1h；依次加入生物素标记的鼠抗人IgE、链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶37。C孵育，用TMB进行显色，室温避光静置10min后，加入2M硫酸溶液终止反应；在450nm波长处测定吸光度。所有统计学分析，均以特异的IgE的平均数比较进行。统计学分析采用Wilcoxon rank－sum t分布检验进行；P＜0.05被认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 粉尘螨Der f cDNA克隆及序列分析 以粉尘螨cDNA文库为模板，我们先采用1对外引物进行PCR，扩增结果见图1Lane1所示无明显条带，扩增不成功。随后我们采用内外引物各1套进行套式PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳，得到1条350bp左右的条带，大小与理论预计相符（图1，2）。这说明套式PCR具有更好的特异性。克隆后测序结果与已经登录 GenBank（accession No.KC669700）的Derf24基因序列数据一致。

图1 PCR扩增Der f24cDNA电泳图谱Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR product of Der f24cDNA

粉尘螨Der f24cDNA序列从启起始密码AUG到终止密码UGA，共357bp，已登录Gen－Bank，登录号为KP064571。具体序列如下：

2.2 pET－His－Der f24重组表达质粒的构建与鉴定 PCR扩增的一对内引物分别添加了BamHI和HindIII位点。通过BamHI和HindIII双酶切Der f24cDNA基因克隆到pET－His载体上，挑取阳性克隆进行双酶切鉴定（图2），并重组质粒进行DNA序列测序确认构建了pET－His－Der f24。

图2 pET－Der f24重组质粒BamHI／HindIIII双酶切Fig.2 Electrophoresis of products of pET－His－Derf24double cut by BamHI／HindIII

2.3 Der f24蛋白表达和纯化 测序正确的表达质粒 pET－His－Derf24 转 化E.coliBL21（DE23）plysS，经IPTG诱导表达目的蛋白，进行SDSPAGE电泳分析，结果显示阳性克隆菌株在Mr 14 000左右处有外源蛋白表达条带出现，与预期大小相符；表达产物主要为包涵体，在超声破碎离心后沉淀里面（如图3）。重组蛋白经变性后溶经Ni2＋Chelating Sepharose FF柱层析纯化再复性，获得纯的重组Der f24蛋白，浓度为0.48mg／mL，平均每升摇瓶可获1.8mg纯品（如图3）。

图3 pET－His－Der f24重组质粒的诱导表达Fig.3 SDS－PAGE analysis of recombinant Der f24

2.4 IgE－Weatern Blotting检测重组Der f24 用粉尘螨过敏患者的血清作为一抗进行IgE－Weatern Blotting实验，设健康对照阴性组。结果显示，重组Der f24与10例粉尘螨过敏患者血清特异性IgE（UniCap检测粉尘螨特异性均在3级以上）呈强阳性反应，不与10例健康对照阴性组血清反应（Uni－Cap检测粉尘螨特异性IgE均为0级）（图4）。

图4 IgE－Western blotting检测重组Der f24Fig.4 IgE－Western blotting for binding assay of rDer f24

2.5 Der f24 3D结构模拟与表位预测 Der f24与参考模板（template：1PP9.F）氨基酸序列的同源性达56%，利用SWISS－MODEL在线软件进行同源建模，模拟其3D分子结构，结果见图5。该分子模型以α螺旋为主，Coil－coli为辅，无β折叠。利用DNASTAR V7.1软件，预测粉尘螨UQCRB样蛋白中的B细胞抗原表位，选取三个肽段，分别为表位肽1：75－88位氨基酸肽段（绿色）；表位肽2：44－57位氨基酸肽段（红色）；表位肽3：104－117位氨基酸肽段（蓝色）见图5。人工合成时N段添加Cys，SH基团便于与BSA偶联（表1）。

2.6 IgE－ELISA测定表位肽与粉尘螨过敏患者血清结合反应 取22份粉尘螨过敏患者血清和22份健康对照阴性血清作为检测对象，进行3个表位肽IgE－ELISA实验。统计学方法分析结果显示，3个表位肽（Peptide 1：75－88aa，Z＝5.6734；Peptide 2：44－57aa，Z＝5.6720；Peptide 3：104－117aa ，Z＝5.6791；3组P＜0.0001）均与22份粉尘螨过敏患者血清特异性IgE结合，均不与22例健康对照阴性血清反应。通过与课题组前期报道的重组Der f24 IgE－ELISA结果相比较[2]，这3个表位肽与粉尘螨过敏性患者血清特异性IgE结合反应较弱（图6）。

表1 粉尘螨过敏原Der f24人工合成表位肽Table 1 Synthesis of Der f24epitope peptides

图5 粉尘螨Der f24 3D模拟结构及其B细胞表位的预测Fig.5 Der f24 3DStructure Modeling and prediction of B－cell epitopes

图6 IgE－ELISA检测表位肽与粉尘螨过敏患者特异性IgE反应性Fig.6 IgE－ELISA for binding assay of rDer f24and its epitope peptides

3 讨 论

尘螨包括粉尘螨（Dermatophagoidesfarimae）、屋尘螨（Dermatophagoidespteronyssinus）埋内欧螨（Euroglyphusmaynei）和热带无爪螨（Blomiatropicalis）等，它们是室内最主要的吸入性过敏原，其螨体、排泄物和分泌物、死亡后分解物等均含有多种致敏成分，能导致人体产生过敏反应并能引起过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎等I型变态反应性疾病[6]。通过IgE－WB、IgE－ELISA、组胺释放、皮肤点刺等实验，从不同种属的尘螨中先后发现了30多种不同的致敏组份，可与尘螨过敏患者血清特异的IgE发生反应，其中已经正式命名的尘螨过敏原组份有24组[2]。第1、2、3、9、11、14和15组尘螨过敏原与尘螨过敏患者血清特异的IgE发生反应反应条带出现频次和反应强度均较高，可能是尘螨的主要过敏原成份[7]。粉尘螨基因组和转录组研究结果显示，粉尘螨不含有第12组和第19组过敏原组份。Weghofer M等研究发现，Der p 23主要存在于螨的肠道中，具有结合几丁质的结构域，可与74%的屋尘螨过敏患者IgE抗体发生结合，是屋尘螨的主要过敏原之一[8]。

本课题组多组学技术首次发现了粉尘螨UQCRB同源物与粉尘螨过敏患者血清IgE呈阳性反应，进一步通过人工合成基因表达纯化而获得了重组粉尘螨UQCRB样蛋白，并对其过敏原性予以初步鉴定，结果显示其皮肤点刺阳性率为50%（5／10）[2]。这一新发现的过敏原被正式命名为第24组尘螨过敏原，即Der f 24。本研究克隆了Der f24cDNA基因并表达纯化获得了重组Der f24。通过IgE－WB实验结果显示，重组Der f24蛋白与粉尘螨过敏患者特异性IgE抗体结合率高达100%（10／10）；另外，IgE－ELISA 显示其阳性反应值／阴性反应值（P／N值）高（图5），说明与粉尘螨过敏患者血清特异性IgE抗体的结合能力强。这也说明了Der f24可能是粉尘螨又1个主要的过敏原成份。

本研究基于Der f24的氨基酸序列，利用SWISS－MODEL在线软件，参考模板 （template：1PP9.F）对粉尘螨UQCRB样蛋白3D结构进行模拟并预测其B细胞抗原表位，选择其中3个进行人工合成肽验证（Epitope 1：75－88aa；Epitope 2：44－57aa；Epitope 3：104－117aa），结果均与与粉尘螨过敏性患者血清特异IgE反应。Der f24表位的初步鉴定为下一步全面鉴定其IgE B细胞表位并明确关键氨基酸提供了基础尘螨过敏原天然提取液中虽然有很多IgE结合蛋白，但大多不稳定，可被内源性蛋白酶降解，且单一过敏原组份由于含量低，很难通过这种天然提取液纯化而大量获取。重组过敏原纯度高、易标准化，在临床诊断和治疗中，相比尘螨浸液提取物有一定的优势[9]。本研究通过原核表达纯化获得了大量高纯度重组Der f24蛋白，且具有很强的结合特异性IgE活性。在目前已经发现的数百种过敏蛋白中，没有报道过具有这一类生化功能的蛋白可以作为过敏原。这为研究过敏反应发生的机制提供了新的线索。本研究为螨性过敏性疾病的发生机制及其诊断和治疗奠定新的技术基础。

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