酶解析-HPLC-ICP-MS同时测定生乳及乳粉中砷形态及质量浓度

赵建国，李琴，陶大利，姜金斗

（农业部乳品质量监督检验测试中心哈尔滨，150090）

0 引言

砷是一种广泛分布于自然界的元素。各种不同的砷形态其物理、化学性质、毒性亦各不相同。其中无机砷的毒性最大如As（Ⅲ）和As（Ⅴ）,有机砷的毒性较小如MMA和DMA,而AsB,AsC和砷糖等通常被认为是无毒的[1]。因此,分析砷在食品的形态对评价对人体危害的风险分析具有重要意义。国家对液态乳总砷限量要求为0.1 mg/kg；乳粉为0.5 mg/kg[2]。

砷不同形态分析研究近年来报道较多，主要集中在水产品及环境样品等[3-14,20-23]，而其他食品[15-16]特别是生乳及乳制品中不同砷形态含量的分析研究方面少有报道[1]。由于通用的原子荧光仅能对样品中的无机砷或经消化处理后的总砷进行测定[17]。其他测定不同砷形态方法如微波萃取-原子荧光光谱法、离子色谱法也有报道[18-19]，但目前对测定不同砷形态仍以HPLC-ICP-MS方法最多。乳品类样品基质复杂，本研究重点集中在样品前处理优化方面：通过酶水解解决了对不同砷形态的吸附问题，通过采用萃取小柱以脱去脂肪。从而实现了对乳品中5种不同砷形态的准确测定。

1 实验

1.1 试剂

无水乙酸钠，硝酸钾，磷酸二氢钠，氢氧化钠，无水乙酸钠，无水乙醇，柠檬酸钠，冰乙酸，乙二胺四乙酸二钠，碱性蛋白酶（20万单位），砷甜菜碱、一甲基砷、二甲基砷、砷酸根、亚砷酸根标准品。

1.2 仪器及材料

Waters 2695高效液相色谱，ICP-MS Elan6000电感耦合等离子体质谱仪；固相萃取装置；PEP-2SPE小柱，200mg/6mL；高速冷冻离心机。

1.3 样品处理

1.3.1 酶解析提取砷

称取生乳样品40 g（精确至0.1 mg）或乳粉样品称取8g（精确到0.1 mg）于锥形瓶中，乳粉用30 mL温水溶解样品。用浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液调pH=9.5后分别加入0.2 g碱性蛋白酶（20万活力单位），放入60℃恒温箱中水解30 min。取出后分别加入质量分数为12%柠檬酸溶液4.0 mL，转入50 mL容量瓶中定容。4℃冰箱中静止5 min，将部分样液转入离心管中，以8 000 r/min离心10 min，同时做试剂空白实验。

1.3.2 固相萃取柱脱脂净化

将PEP-2SPE小柱置于固相萃取装置上，用5mL甲醇活化，用5mL去离子水过柱并排干，吸取2mL样液过柱弃掉后，再吸取3mL样液通过小柱,并接收于试管中，通过0.45 μm滤膜过滤后用于测定。

1.4 分析方法

1.4.1 色谱条件

色谱柱：阴离子保护柱IonPac AG 19（50 mm×4 mm,11 μm）；阴 离子分析柱IonPac AS 19（250 mm×4mm,7.5 μm）；柱温 35 ℃ ；流速 1.0mL/min；进样量50μL；流动相[10 mmol/L无水乙酸钠+3mmol/L硝酸钾+2.0 mmol/L磷酸二氢钠+0.2 mmol/L乙二胺四乙酸钠，用4.0%NaOH溶液调节pH=10.7]∶无水乙醇为99∶1。

1.4.2 ICP-MS条件

积分时间1 s；功率1 100 W；玻璃同心雾化器；载气流量1.0L/min；辅助气流量1.2 L/min；采集质量数74.9216；灵敏度≥260 mg/L；进样管内径≤0.2 mm。

1.4.3 标准曲线配制

分别用超纯水将5种形态砷质量浓度分别为10.0μg/mL的标准贮备溶液逐级稀释，配制成质量浓度为 0.0，1.0，2.0，5.0，10.0 ng/mL的标准系列溶液。在优化的实验条件下,测定系列标准溶液,等离子体色谱软件计算各色谱峰的积分面积并自动绘制校准曲线。

2 结果与讨论

2.1 样品处理的优化

2.1.1 蛋白质等吸附对不同砷形态测定结果的影响

由于生乳及乳粉中成分复杂，蛋白质及脂肪质量分数较高，基质干扰大。为能达到既能有效降低基质干扰，又能准确测定各组分质量分数的目的，前处理技术尤为重要。由于乳蛋白具有较强的吸附性，对不同砷形态可能具有明显的吸附作用，若不能从中解析出来就会造成测定结果偏低，达不到准确测定的目的。为此通过加入碱性蛋白酶的方式将蛋白质进行降解后测定收到显著的效果。

由于样品中各组分质量浓度甚微，为此采用加入标准样品的方式以考察蛋白对待测物因吸附而造成的影响。其实验方法为将生乳在高压灭菌锅中灭菌后取出，冷至室温后在超净工作台中分别称取40 g样品置于150 mL锥形瓶中，分四组，每组4个样品。每组中3个样品分别加入各含有0.250 μg砷不同形态的标准样品，1个样品作为空白。先取其中两组其中一组加入碱性蛋白酶、一组不加入碱性蛋白酶直接按1.3样品处理方法进行处理后测定其质量浓度；另两组密闭后在无菌状态室温下放置2周，按上法进行处理后分别测定其质量浓度，以考察各组分变化情况。通过测定，所有未加入标准品的样品各组分均未检出，在表1中就不再一一列出，结果如表1所示。

由表1可以看出，加入标准砷样品后直接测定两组处理，不同砷形态回收率测定结果加酶处理稍高于未酶处理，但无变化显著差异。而加入标准砷样品放置两周后再测定则差异显著，特别是AsⅢ未加酶回收率仅81.2%，加酶处理达99.2%，说明乳蛋白对不同砷形态各组分都有一定的吸附。采用碱性蛋白酶将乳蛋白降解后可有效释放出被吸附的砷。

表1 碱性蛋白酶处理前后不同砷形态测定结果（n=3）

2.1.1 PEP固相萃取小柱处理后对测定结果的影响

由于生乳及乳粉中含有较高的脂肪，根据该色谱柱的特性，若大量的脂肪进入阴离子分析柱，将会使脂肪吸附于色谱柱内很难被洗脱，从而即影响色谱柱的分离，同时又可使色谱柱寿命大大缩短。另外若脂肪被导入等离子焰炬中会造成锥管等处积碳，从而使灵敏度降低，基质干扰增大，为此必需先将样品中脂肪去除。脂肪去除方式可采用有机溶剂如正己烷等去除，也可采用固相萃取小柱。本研究采用固相萃取小柱去除脂肪效果较好，且操作简便，同时避免了因大量使用有机溶剂而对人体产生的危害。

2.2 方法线性范围与检出限

按照1.4分析方法,分别对5种形态砷标准溶液进行测定，在系列浓度范围内呈良好的线性关系（见图1和表1）。采用生乳样品按照1.3样品处理方法处理后对各组分进行了最低检出限的测定，并以本底3倍噪音分别计算样品最低检出限，结果如表2。

图1 5种不同砷形态标准曲线

由表2可知，5种形态砷标准曲线线性较好，相关系数（r）在0.9996～0.9999间；最低检出限在0.5～1.6 μg/kg间。完全可以满足国家限量标准乳中总砷为0.1 mg/kg规定测定的要求。

2.3 方法的回收率和精密度

分别选取婴儿配方奶粉与生乳添加五种形态砷标准溶液后按1.3进行样品处理，测定回收率；分别称取6份婴儿配方奶粉与生乳样品后再分别添加0.250 μg混合标准溶液，处理液分别进样测定精密度，未添加标准溶液的两样品测定值均为小于检出限。经测定，两样品各组分不同添加量回收率平均值AsB，DMA，AsⅢ，MMA，AsV分别为99.4%，92.7%，101.1%，91.8%，92.0%，两个样品RSD平均值分别为4.54%，4.39%，5.58%，4.92%，4.68%。回收率与精密度测定结果如表3和表4所示。

表2 5种形态砷分线性回归方程与最低检出限

3 样品分析

选取乳粉、生鲜奶各3种,按所建立的HPLC-ICP-MS的分析方法检测5种形态砷含量,以验证实际应用的可靠性。结果参见表5。图2为奶粉样品与标准溶液中5种形态砷的色谱图。结果表明,所检测样品中只检测出了AsⅢ和AsV，其含量极低，远低于国家限量标准,故样品中无机砷的指标是安全的。

图2 标准溶液及奶粉样品提取液色谱

4 结论

（1）本研究建立了生乳与乳制品中5中形态砷的液相色谱-电感耦合等离子质谱测定方法。该法具有样品处理简单、测定周期短、灵敏度高等优点。

（2）通过对样品前处理方法的优化。通过在样品中加入砷标准混合溶液，放置2周后采用碱性蛋白酶水解前后的比较，发现水解乳蛋白后可将吸附态的砷解析。酶水解液再加入3%柠檬酸可进一步去除杂质，从而大大减小了基质干扰。样液再通过PEP固相萃取小柱处理则可有效去除样液中的脂肪，使色谱柱的分离度显著提高、色谱柱的寿命延长。通过上述对样品的处理，从而实现了准确测定乳品中5种形态砷质量分数，大大提高了检测灵敏度；AsB，DMA，AsⅢ，MMA，AsV 最低检出限分别达到 0.56，0.54，1.56，1.56，0.84 μg/kg，满足了对痕量成分测定的要求。

（3）该方法砷质量浓度在0～10 ng/mL的范围内呈良好的线性关系。5种形态砷其相关系数（r）全部在0.999以上。

（4）AsB，DMA，AsⅢ，MMA，AsV的加标回收率平均值分别为99.4%，92.7%，101.1%，91.8%，92.0%；RSD平均值分别为4.54%，4.39%，5.58%，4.92%，4.68%。完全能满足微量成分定量测定的要求。

表3 样品中5种形态砷回收率测定结果

表4 样品5种形态砷精密度测定结果

表5 生乳与乳粉中5种形态砷测定结果（n=3） μg·kg-1

（5）通过对生乳及乳粉样品的测定，只检出了AsⅢ和AsV，其质量分数远低于国家限量标准[2]要求。

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