哮喘动物模型建立的思考与体会*

谭杰军　王甜甜　刘志伟　曲婉莹　景伟超　施国善　李志军△王有鹏△（.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 50040；.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨 5000）



哮喘动物模型建立的思考与体会*

谭杰军1王甜甜1刘志伟1曲婉莹1景伟超2施国善1李志军2△王有鹏2△
（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨 150001）

实验动物模型的建立对于哮喘病因、病机及防治方面的研究至关重要。笔者基于对国内外诸多哮喘实验动物模型建立方法与相关知识的学习和思考，结合自身实践经验，提出几点心得和体会，以资与同道互相探讨学习。

支气管哮喘动物模型思考体会

【Abstract】The establishment of experimental animal model for the etiology，mechanism and prevention of asthma is of crucial importance.The author puts forward several ideas and experience to discuss with fellows and learn from each other，based on the study and thinking of the methods of the establishment of experimental animal model of asthma home and abroad and the related knowledge.

【Key words】Bronchial asthma；Animal models；Thinking；Experience

支气管哮喘（简称哮喘）作为严重危害人体健康的常见疾病，其预防、控制和治疗已成为全球性的健康难题。实验动物模型的建立对于哮喘病因、病机及防治方面的研究至关重要。遗憾的是，由于各研究者所在实验室条件高低参差不同，文献中的模型建立方法在国内经常不能成功复制，或出现诸多问题，影响实验的正常进行和研究的顺利开展。基于对国内外诸多哮喘实验动物模型建立方法［1-7］与相关知识的学习和思考，笔者将结合自身实践经验，就实验动物及条件控制、致敏剂与致敏方法以及模型判定等几方面加以探讨阐述，提出几点心得和体会，以资与同道互相探讨学习，期望能对普通实验条件下哮喘动物实验研究的开展，有所借鉴帮助。

1　建立哮喘动物模型的必要性

鉴于人体研究的局制以及伦理学的严格限制，哮喘的研究需要通过建立动物模型来进行，这是研究成功的关键。研究者可以通过动物模型把人体中类似的复杂情形复制出来，通过严格控制条件，排除各种干扰因素，对疾病加以研究。此外，还可采用某些在人体研究中不宜使用的方法和手段。但考虑到动物的气道结构远不如人类复杂，加之哮喘病因病机错综万千，受多种因素影响，如遗传背景、过敏原、环境因素等，一种动物模型无法完全复制出人类哮喘的整个病理生理过程，而只能重现哮喘生理病理变化的某些特定阶段。因此，选择并建立合适的动物模型非常重要。毋庸置疑，尽管其存在一定的不足，但通过动物模型我们得到大量有效信息，对人类哮喘有了深刻透彻的认识。

2　实验动物的选择

建立哮喘动物模型，是利用所选品系的物种更好地模仿哮喘的过程与特征。兔、猫、犬、羊及灵长类不能自发哮喘，且一般需人工诱发，都不是理想的选择对象。绵羊及灵长类虽可模拟人类对药物的反应，但价格昂贵，可能发生微生物的亚临床感染，不予选择。目前制作哮喘模型多选用豚鼠、大鼠与小鼠。

2.1豚鼠豚鼠易被致敏，且反应的靶器官为肺脏，接触致敏原后产生Ⅰ型变态反应，程度较大鼠、小鼠强，且雾化激发后能产生速发相与迟发相两种哮喘反应，因而应用广泛。但豚鼠个体差异大，致敏过程中个别不出现反应，而其他个体却出现种群依赖性的夸大反应，如过敏性休克等。从免疫学方面讲，与人类变态反应主要由IgE介导不同，豚鼠的主要由IgG1介导。此外，豚鼠繁殖率较低，缺乏基因型明确的种系，相关的免疫学与分子生物学试剂相对不足，尽管能发生很好的气道炎症，但要进一步深入研究遗传与免疫机制则比较困难［8］。由于上述原因，其应用受到一定限制。

2.2大鼠近年来，大鼠模型使用逐渐增多，国外多用Brown-Norway大鼠，易受国际医学杂志认可。其优点在于能够产生针对过敏原的特异性IgE抗体，而且更易诱发出哮喘症状以及气道变应性炎症与气道高反应。但目前，我国常用的SD大鼠、Wistar大鼠等稳定性欠佳，很难被较高水准的国际医学杂志认可，不宜用于哮喘研究，在此其优缺点不再赘述。

2.3小鼠小鼠常用于呼吸道变态反应的研究。它们的免疫遗传学背景清楚，方便使用转基因技术，成本较低，并被允许进行大规模研究。随着实验技术和检测手段的发展，针对小鼠的特异性免疫学试剂的大量出现，以及基因技术的广泛应用，使小鼠模型便于进行变态反应机制的研究。常用的小鼠品系有BALB/c、C57BL/6、CBA、C3H、A/J等［9］，以前两种最常用。

然而，现存的小鼠哮喘模型有许多局限性。首先，不出现类似人类哮喘的黏膜炎症和上皮层嗜酸性粒细胞浸润；其次，致敏和激发往往需要多次，否则不会出现人类哮喘典型的慢性气道炎症和上皮变化；最后，会出现过敏性肺泡炎或超敏性肺炎，掩盖了气道的炎症损害［10］。此外，小鼠体积小，体质量轻，气道短，这给操作及取材带来许多困难。

笔者认为，基于生物特性考虑，过敏性疾病的研究以豚鼠为佳，免疫及基因手段的应用首选小鼠。“雌雄不拘”一般不可取，同笼饲养更是不可行。哮喘模型的建立以及后续实验往往超过4周，期间若发生交配、孕娩、哺乳等事件，以及更为严重的因争夺雌鼠而发生的雄鼠打斗，都会严重影响研究结果的准确、稳定和可靠。如果分笼饲养并分属不同组，雌雄之间本有差异不具可比性。一般哮喘研究建议选用同一性别的动物。为避免雌激素及生理周期的影响，多选雄性；小鼠则选雌性，因其变应性气道炎症比雄性更为显著，嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润更为明显，同时支气管肺泡灌洗液中炎症细胞数也较多。值得注意的是，考虑到实验过程中可能出现的误伤、死亡，动物个体差异性及个别采集样本的不合格等因素，论文“结果”描述时，应标明入组例数与实际检测例数，这可以增强研究论文的可信性。

3　模型建立

哮喘模型建立的要素诸多，篇幅有限，本文在此不一一提及，仅结合自身实践就一些主要问题加以探讨。

3.1严格筛选实验动物和改进饲养条件实验时应选择较易诱出变态反应的动物，为避免实验前接触环境中可能存在的鸡卵清蛋白（OVA），入组动物应从母代就接受特殊饲料喂养，并由动物中心专业专职人员负责，严格按照清洁级饲养标准进行，如无菌环境、恒温恒湿等，避免环境因素对实验的干扰。

3.2致敏剂及致敏方法致敏方法能够影响研究对象的过敏反应，合理的模型选择需要综合考虑致敏原与佐剂的类型、致敏原输入方式及剂量等。模型建立时应选用与人类哮喘相关联的抗原来进行致敏和激发，且输入方式也应同人类哮喘发生的生理病理机制相适合。

3.2.1致敏剂及佐剂的选择基于大量研究报道，致敏阶段推荐被动免疫中复合形式的OVA致敏及激发，以OVA为致敏原（一般致敏时用Ⅴ级、激发时用Ⅱ级），Al（OH）3为免疫佐剂。

致敏剂一般由抗原和佐剂组合而成，佐剂能够增强免疫原性及免疫应答，防止脱敏情况发生。作为经典的致敏原，OVA为异种蛋白，有很强的抗原性和免疫原性，易于获得，常与Al（OH）3联合使用。实验中我们发现氢氧化铝干粉难溶于水，与OVA不能很好混合，静置后明显分层，在进行腹腔或皮下注射时极易堵塞针头，严重影响致敏效果。佐剂与抗原的混合程度影响致敏原的免疫原性，故我们在Se-Woong Oh等方法的基础上，选用硫酸铝钾代替Al（OH）3干粉（Sigma公司的凝胶剂也可以，但价格较昂贵［11］。董峰等在哮喘造模中发现Al（OH）3凝胶在增强OVA致敏反应的效果上优于干粉剂）［12］。硫酸铝钾易溶于水，常用作诱导Th2型免疫反应的佐剂，这符合哮喘的免疫反应特点。实验中我们用NaOH调节pH值，硫酸铝钾与NaOH反应生成Al（OH）3，形成混悬小球后与OVA混合充分，增强了致敏效果，且不堵塞针头。

3.2.2致敏方法的改进增加致敏部位有利于哮喘气道慢性变应性炎症模型及气道重塑模型的建立。Christina A.Herrick等发现皮肤是重要的致敏器官，单纯腹腔注射不能很好地诱发Th2型变态反应，故实验中我们建议采用腹腔注射和皮下注射相结合的方法，多点致敏［13］。

在激发时影响模型成功的因素主要有：激发时间与激发频次、雾化器、激发时OVA的浓度。首先，慢性哮喘模型的建立方法与急性相比，主要区别在于激发时间更长。为了更好地模拟气道慢性炎症过程这一哮喘本质，我们延长了雾化激发时间，并采用连续激发14 d，小鼠每次30 min，豚鼠则从30 s开始逐渐适应性延长，以形成典型的慢性变应性炎症。当然，气道重塑模型则需要在此基础上至少延长2周。其次，压缩雾化激发的方式要优于传统的超声雾化激发［14］。压缩雾化方法产生的颗粒较小，平均中位直径3.5 μm，能很好地进入小气道，从而诱导小气道炎症，而超声雾化器产生的雾化颗粒大，大部分作用于口咽部，不能到达小气道，因而激发效果不好［15］。激发时的OVA浓度较多选用1%。

4　模型的判定

目前对于哮喘模型建立是否成功，尚没有一个规范的统一判断标准。哮喘的动物模型多种多样，但均应具备气道变应性炎症和气道高反应性的两大基本特征。验证模型是否成功主要从以下4个方面入手：动物的总体外观及行为学表现；炎症细胞分类及计数；病理组织观察；气道反应性测定。

4.1总体外观及行为学表现通常结合动物模型的整体外观以及类似人类哮喘发作的典型表现，如烦躁不安或安静少动、点头呼吸、呼吸加深加快、前肢缩抬、弓背直立、二便失禁等，判断模型是否成功，并进一步评价药物作用。

4.2炎症细胞分类及计数既往多采用瑞氏-吉姆萨染色法，但实际操作中，由于支气管肺泡灌洗液标本较稀薄，受灌洗操作水平影响较大，普通推片及甩片机甩片效果均不理想，炎症细胞在玻片上薄厚疏密分布不均，涂片染色时易脱片，这直接影响镜下观察及计数。我们结合史菲等支气管肺泡灌洗术标准化操作，根据实际情况进行标本采集，采用液基沉降法涂片，HE染色法染色计数，效果比较满意［16］。此外，Diff Quik染色虽成本稍高，效果也比较理想。

4.3病理组织观察光镜下进行模型动物病理组织检查，观察其变化。并采用HE染色及其结果的Ashcroft评分观察支气管及肺组织炎性细胞浸润情况，方法不再赘述。

4.4气道反应性的测定我们采用无创性体外非侵入性检测法进行气道反应性的测定。其具有以下优点：1）小鼠非限制性；2）手段非侵入性；3）小鼠在清醒状态下自主呼吸；4）小鼠无感觉缺失；5）可用于长时间和重复检测。实验中应用整体容积描记箱（体描箱）记录小鼠呼吸曲线，并计算出Penh值，然后根据Penh值的变化，运用全身性体积描记法（WBP）无创性地测定小鼠气道反应性。Penh（enhanced pause）=［呼气峰压（PEP）/吸气峰压（PIP）］×［呼气时间（Te）-松弛时间（Tr）］/Tr，简之，即Penh=（PEP/PIP）×Pause，Pause=（Te-Tr）/Tr，Tr是呼气压力降为36%时所经历的Te。实验时按浓度梯度给予乙酰胆碱，计算Penh较基线增高的倍数来反映气道反应性的高低。相较而言，有创性检测方法可直接检测气道阻力和顺应性，但需要麻醉状态下气管插管，对气道反应性会产生影响，且不能用于长期反复检测，因此无法用于对哮喘肺功能变化的动态研究，不能用于观察药物干预作用的动态变化。

哮喘实验动物模型的制备方法及模型成功的评判标准，仍需在今后的研究中进一步规范，以促进哮喘研究的深入发展。

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Thinking and Experience of Establishing Animal Models of Asthma

TAN Jiejun，WANG Tiantian，LIU Zhiwei，et al.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150040，China.

R562.2+5

A

1004-745X（2016）05-0816-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.018

国家自然科学基金项目（81473724）；哈尔滨市应用技术研究与开发项目（2014RFXJ098）；黑龙江中医药大学研究生创新科研项目（2015-08）
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（电子邮箱：wangyp8899@163.com）

2016-01-27）