人参二苓汤及其水提醇沉提取物对H22荷瘤小鼠脾胸腺指数及外周血细胞的影响

程 权傅华洲

人参二苓汤及其水提醇沉提取物对H22荷瘤小鼠脾胸腺指数及外周血细胞的影响

程 权1傅华洲2

目的探讨人参二苓汤及其水提醇沉提取物对H22荷瘤小鼠脾胸腺指数及外周血细胞的影响。方法将60只健康昆明小鼠分为正常组、荷瘤模型组、阳性对照组（CTX组）、水提组（RSEL）、总多糖组（PRSEL）、小分子组（SRSEL），每组10只。建立H22荷瘤小鼠模型，造模成功后分别灌服人参二苓汤水提物、总多糖、小分子，实验结束后计算小鼠脾胸腺指数，抑瘤率及外周血细胞的检测。结果人参二苓汤水提物（RSEL）组和总多糖（PRSEL）组抑瘤率分别为37.80% 和50.13%；CTX组为79.62%；CTX组及人参二苓汤水提组和总多糖组平均瘤重分别为（0.7611± 0.1502）g、（2.3231±0.5324）g和（1.8642±0.5740）g，与荷瘤模型组平均瘤重（3.7352±0.4851）g比较，差异有统计学意义（P＜0.01），小分子组瘤重与荷瘤组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与水提组比较，总多糖组瘤重差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，人参二苓汤总多糖（PRSEL）组能显著增强荷瘤小鼠脾和胸腺指数（P＜0.05或P＜0.01），且较人参二苓汤水提物（RSEL）组和小分子（SRSEL）组更为显著；人参二苓汤总多糖（PRSEL）组能改善荷瘤小鼠晚期白细胞的过度增高状态（P＜0.01），优于人参二苓汤水提物组（P＜0.05）。结论人参二苓汤总多糖（PRSEL）可以明显延缓荷瘤小鼠晚期类白血病样反应的发生，维持血细胞在一个相对稳定的状态，且抑制肿瘤生长作用较明显，可能与其改善荷瘤小鼠免疫器官功能相关。

H22荷瘤小鼠；人参二苓汤；总多糖；外周血细胞

为研究人参二苓汤抗肿瘤作用有效部位及其作用机制，本实验通过建立H22肝癌移植瘤模型，观察人参二苓汤及其水提醇沉提取物对荷瘤小鼠的肿瘤生长、脾和胸腺指数以及外周血细胞的影响，报道如下。

1 实验材料

1.1 动 物 SPF级昆明小鼠60只，雄性，体质量（20±2）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，实验动物许可证号[SYXK（浙）2012-001]。所有小鼠在相同条件下，标准饲料饲养于浙江中医药大学动物实验中心。

1.2 细胞株 小鼠H22肝癌瘤株，由浙江中医药大学生命科学学院实验室提供。

1.3 主要药品及试剂 人参二苓汤药材由杭州市第一人民医院中药房提供；环磷酰胺（CTX，江苏恒瑞医药股份有限公司产品，批号14081425）；无支原体胎牛血清（杭州四季青生物有限公司），细胞培养基1640（杭州吉诺生物有限公司）。

1.4 主要仪器 全自动血液分析仪（SYSMEX CORPORPORATION），旋转蒸发仪（上海申胜科技有限公司），数控恒温水浴锅（上海申胜科技有限公司），SHZ-D（Ⅲ）循环式真空泵（巩义市予华仪器有限公司），DLSB-低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司），SK2510HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司），荧光倒置显微镜（日本NIKON公司），SW-CJ-1F超净工作台（苏州泰安空气技术有限公司）。细胞培养管（THERMO），万分之一精密电子天平（AR21300haus-Corppine Brook，NT，USA）。

2 实验方法

2.1 肿瘤模型的制备 取接种肿瘤后7天且生长良好的H22肝癌腹水型荷瘤小鼠，将其颈椎脱臼处死，在无菌条件下抽取乳白色腹水，用生理盐水稀释成密度为1×107/mL的H22细胞悬液。用台盼蓝计数法，显微镜下观察并计数活细胞数＞95%，以0.2 mL/只接种于昆明小鼠右腋皮下，制备H22肝癌实体模型[1]。

2.2 分组及给药

2.2.1 分 组 荷瘤小鼠造模24h后，将动物随机分为正常组、模型组、阳性对照组（CTX组）、水提组（RSEL）、总多糖组（PRSEL）、小分子组（SRSEL），每组10只。

2.2.2 给 药 按《中药药理实验方法学》附表“人和动物间接体表面积折算表”，计算出各组给药剂量，人参二苓汤总多糖组用水提醇沉法提取其中多糖部分，Sevege法去除其中的游离蛋白，获得人参二苓汤复方总多糖，水提醇沉上清液为人参二苓汤小分子部分，分别旋干低温保存备用，以及水提物的旋干物，最后三组给药剂量都控制在2.925g/kg，用生理盐水稀释灌胃给药，最后每组每天分别均给药0.4mL/只。H22荷瘤小鼠造模成功24h后，人参二苓汤各部分组开始灌胃给药0.4mL/只，阳性对照组给予环磷酰胺（CTX）0.4mL/只（50mg/kg），腹腔注射，隔天给药，模型对照组和正常组给予生理盐水灌胃0.4mL/只，每天1次，连续给药14天。

2.3 相关指标检测 第15天称取小鼠质量，在无菌条件下摘眼球取血于抗凝EP管，检测血细胞含量。解剖死亡小鼠，称取脾胸腺质量，计算脾胸腺指数及抑瘤率。器官指数=器官质量/体质量×1000（mg/g）；抑瘤率（%）=［（对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/对照组平均瘤重］×100%。

2.4 统计学方法 应用SPSS19.0软件，实验数据以均数±标准差（±s） 表示，采用单因素方差分析。

3 实验结果

3.1 人参二苓汤及其水提醇沉提取物对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的影响 与模型组比较，RSEL组及PRSEL组对肿瘤质量均具有显著降低作用（P＜0.01）；与RSEL组比较，PRSEL组小鼠瘤质量降低更显著（P＜0.05），RSEL组和 PRSEL组抑瘤率分别为37.80%，50.13%。见表1。

3.2 人参二苓汤及其水提醇沉提取物对H22荷瘤小鼠脾胸腺指数的影响 与正常组比较，RSEL组、PRSEL组脾脏和胸腺指数提高（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，RSEL组、PRSEL组胸腺指数增高（P＜0.01），SRSEL组胸腺指数变化不大（P＞0.05）。与模型组比较，人参二苓汤RSEL组和PRSEL组荷瘤小鼠脾脏指数差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 人参二苓汤及其水提醇沉提取物对H22荷瘤小鼠肿瘤

表2 人参二苓汤及其水提醇沉提取物对H22荷瘤小鼠脾、胸腺指数的影响（mg/g，±s）

表2 人参二苓汤及其水提醇沉提取物对H22荷瘤小鼠脾、胸腺指数的影响（mg/g，±s）

注：与正常组比较，△P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与CTX组比较，▲P＜0.01；CTX：环磷酰胺；RSEL：人参二苓汤水提；PRSEL：人参二苓汤复方总多糖；SRSEL：人参二苓汤小分子部分

组别正常组荷瘤模型组CTX组RSEL组PRSEL组SRSEL组鼠数10 10 10 10 10 10脾指数8.11±0.31 8.78±2.43 7.68±2.10 12.04±1.65**△▲13.62±2.02**△▲10.26±1.54△胸腺指数2.26±0.24 2.45±0.35 1.84±0.33 3.09±0.70*△▲3.66±0.76**△▲2.91±0.62

3.3 人参二苓汤及其水提醇沉提取物对H22荷瘤小鼠外周血WBC、PLT数量的影响 与模型组比较，人参二苓汤总多糖及水提物改善小鼠外周血WBC含量均较为显著（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组红细胞、血小板变化差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 人参二苓汤及其水提醇沉提取物对H22荷瘤小鼠外周血WBC、RBC、PLT数量的影响（±s）

表3 人参二苓汤及其水提醇沉提取物对H22荷瘤小鼠外周血WBC、RBC、PLT数量的影响（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.01；与RSEL组比较，△P＜0.01；CTX：环磷酰胺；RSEL：人参二苓汤水提；PRSEL：人参二苓汤复方总多糖；SRSEL：人参二苓汤小分子部分

组别正常组荷瘤模型组CTX组RSEL组PRSEL组SRSEL组鼠数10 10 10 10 10 10 WBC（109/L）5.55±1.45 28.86±9.93 8.56±3.43 11.19±6.35** 8.85±3.91**△35.58±7.36 RBC（1012/L）10.23±1.55 6.84±0.54 6.06±1.10 7.45±1.56 7.47±1.92 7.55±0.77 PLT（109/L）1611.25±469.34 1774.60±253.03 1339.83±326.77 1652.25±311.40 1607.44±413.16 2081.60±410.00

4 讨 论

相关研究表明，中药多糖具有抗病毒以及抗肿瘤等生理活性[2]。目前单味中药的多糖研究较多，复合多糖研究正在被关注。人参二苓汤由生晒参、猪苓、茯苓、薏苡仁、蝉蜕、防风、白术、甘草组成，具有补气健脾、燥湿利水等功效。前期临床研究[3-6]该方对于肿瘤相关疾病的免疫调节疗效均较为显著。本实验结果在一定程度上证实人参二苓汤复合多糖改善荷瘤小鼠脾和胸腺的功能，且效果优于水提物组及小分子组（P＜0.05）。

多糖的免疫调节作用是通过宿主中介途径，且大多无细胞毒性，并不影响正常细胞，诱导细胞因子的产生和受体的表达，同时刺激机体的免疫活性细胞的成熟分化以及繁殖，调节荷瘤小鼠失衡的免疫状态[7-8]。人参二苓汤总多糖可能通过提高晚期荷瘤小鼠免疫功能来明显改善白细胞水平，维持一个相对稳定的血细胞数量，延迟类白血病样反应的发生，从而延长荷瘤小鼠的生存期。人参二苓汤总多糖改善荷瘤小鼠免疫机制有待更进一步的研究和证实。

［1］吴先闯，杜钢军，宋晓勇，等.玉米须多糖对环磷酰胺治疗H22荷瘤小鼠机体损伤的减毒增效作用［J］.中药材，2014，37（10）：1833-1836.

［2］Yan H，Xie YP，Sun SG，et al.Chemical analysis of Astragalus mongholicus polysaccharides and antioxidant activity of the polysaccharides［J］.Carbohyd Polym，2010，82（10）：636-640.

［3］金莉，傅华洲.人参二苓汤防治胃癌化疗后不良反应及其对免疫功能的影响［J］.中华中医药学刊，2012，21（5）：1182-1184.

［4］傅大治.人参二苓汤联合替吉奥胶囊治疗晚期胃癌56例临床观察［J］.中国中医药科技，2012，19（2）：168-169.

［5］傅大治.人参二苓汤联合培美曲赛、卡铂治疗晚期非小细胞肺癌46例临床观察［J］.浙江中医药大学学报，2012，36（9）：998-1000.

［6］傅大治.人参二苓汤联合厄洛替尼治疗晚期非小细胞肺癌临床观察［J］.中华中医药学刊，2013，31（2）：442-443.

［7］Kim HS，Kim YJ，Lee HK，et al.Activation of macrophages by polysaccharide isolated from Paecilomyces cicadae through toll-like receptor 4［J］.Food and Chemical Toxicology，2012，50（9）：3190-3197.

［8］Schepetkin IA，Quinn MT.Botanical polysaccharides：macrophage immunomodulation and therapeutic potential［J］. International Immunopharmacology，2006，6（3）：317-333.

（收稿：2015-10-26 修回：2015-11-24）

Effects of Renshen Erling Decoction and Its Water Extract from Alcohol Precipitation on Spleen Index and Thymus Index and Peripheral Blood Cells of H22 Tumor-bearing Mice

CHENG Quan1,FU Huazhou21Second Clinical College,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;2 Department of TCM, First People's Hospital of Hangzhou,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the Renshen Erling decoction and its water extract from alcohol precipitation on spleen index and thymus index and peripheral blood cells in H22 tumor-mice.MethodsSixty healthy KM mice were randomly divided into 6 groups:control group,tumor-bearing model group,positive control group （CTX group）,Renshen Erling decoction-water extract group（RSEL）,Renshen Erling decoction-total polysaccharide group（PRSEL）,and Renshen Erling decoction-small molecule group（SRSEL）,with 10 mice in each group.H22 tumor-bearing model was established in all group except control group,then mice in each group were treated with the corresponding drugs for 14d.On day 15,mice in each group were sacrificed for calculation of spleen and thymus index and inhibitory rate and counting of peripheral blood cells.ResultsThe inhibitory rate were 37.80%, 50.13%,and 79.62%in RSEL group,PRSEL group and CTX group,respectively;the average tumor weight in CTX group,RSEL group,and PRSEL group were 0.7611±0.1502g,2.3231±0.5324g and 1.8642±0.5740g,respectively, with a significant difference compared to tumor-bearing model group（3.7352±0.4851g,P＜0.01）;no significant difference was found between that of SRSEL group（3.5072±0.278g）and tumor-bearing model group（P＞0.05）;a significant difference was noted between RSEL group and PRSEL group（P＜0.05）.The spleen index and thymus index of PRSEL group were higher than that of tumor-bearing model group（P＜0.05 or P＜0.01）and even higher than thatof RSEL and SRSEL groups.The excessive increase of leucocyte in advanced tumor-bearing mice was inhibited in PRSEL group（P＜0.01）and the inhibition effect was better compared to that in RSEL group（P＜0.05）.ConclusionRenshen Erling decoction-PRSEL can significantly delay the leukemoid reaction of tumor-bearing mice and maintain their blood cells in a relatively stable state.Its effect on inhibiting tumor growth is clear,which may be related to its role in improving the function of immune organs in mice.

H22 tumor-bearing mice;Renshen Erling decoction;total polysaccharide;peripheral blood cells

浙江省中医药科技计划项目（No.2013ZA105）

1浙江中医药大学第二临床医学院（杭州 310053）；2杭州市第一人民医院中医科（杭州 310006）

傅华洲，E-mail：fuhuazhou@126.com