银杏叶片对土三七诱导大鼠肝小静脉闭塞病的干预作用

徐利君 陈赛贞 徐红燕 林利芬 田自有 曹学全 陈文举

银杏叶片对土三七诱导大鼠肝小静脉闭塞病的干预作用

徐利君 陈赛贞 徐红燕 林利芬 田自有 曹学全 陈文举

目的观察银杏叶片对土三七诱导的大鼠肝小静脉闭塞病（HVOD）的干预作用。方法雌性SD大鼠42只，采用土三七诱导建立大鼠HVOD模型，随机分为对照组10只，模型组12只，银杏叶片低、高剂量组10只。对照组大鼠给予蒸馏水7mL/（kg·d）灌胃；模型组给予土三七浓缩煎液7mL/（kg·d）灌胃；银杏叶片低、高剂量组分别给予土三七提取液[7mL/（kg·d）]+银杏叶片[50mg/ （kg·d）]、土三七提取液[7mL/（kg·d）]+银杏叶片[100mg/（kg·d）]灌胃；4周后处死大鼠，采集血清、肝组织，检测血清学指标、观察肝组织病理学变化，评价肝脏胶原表达及纤维化程度。结果银杏叶片低、高剂量组大鼠总胆红素（TBILI）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、血清透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）等较模型组均有显著降低[TBILI：（2.43±1.00）μmol/L、（2.28±0.55）μmol/L比（6.02±1.26）μmol/L，P＜0.05；ALT：（117.44±35.24）U/L、（98.13±13.50）U/L比（143.54±23.25）U/L，P＜0.05，P＜0.01；AST：（220.44±48.13）U/L、（198.20±41.64）U/L比（303.92±51.53）U/L，P＜0.05，P＜0.01；HA：（157.80±41.63）ng/mL、（162.63±13.48）ng/mL比（189.72±23.30）ng/mL，P＜0.05，P＜0.01；PCⅢ：（16.26±2.86）ng/mL、（14.40±1.73）ng/mL比（20.50±4.52）ng/mL，P＜0.05，P＜0.01]；银杏叶片低、高剂量组大鼠血白蛋白（ALB）较模型组显著增加[（31.95±1.64）、（32.48±1.33）g/L比（29.08±3.62）ng/ L，P＜0.05]，银杏叶片高剂量组Ⅳ型胶原（Ⅳ-C）较低剂量治疗组下降更明显[（2.58±0.36）ng/mL比（3.16±0.76）ng/mL，P＜0.05]；病理学检查示，银杏叶片各剂量组较模型组肝纤维化程度轻，其中高剂量组改善更显著。结论银杏叶片对土三七诱导的大鼠HVOD有明显的防治作用。

大鼠；肝小静脉闭塞病；银杏叶片；土三七

土三七（gynura segetum），又名菊三七，是一味民间常用的中草药，具有止血、散瘀、消肿止痛的功效，对于鼻出血、咳血、便血、外伤出血、跌打损伤等有较好的疗效，但其可导致与细胞毒药物环磷酰胺相似的肝小静脉闭塞综合征[1]。肝小静脉闭塞综合征（hepatic veno-occlusive disease，HVOD）是指肝小叶静脉和肝小静脉支内皮肿胀、纤维化，从而导致管腔狭窄甚至闭塞继而发生肝细胞萎缩、弥漫性肝纤维化，临床表现为肝脏肿大疼痛、腹水、黄疸等[2]，其中肝星状细胞的激活和转化是肝纤维化的中心环节与必要环节。据文献[3]报道，银杏叶提取物能抑制肝星状细胞的活化和扩张血管，改善管腔的狭窄程度和纤维化程度，有效防治肝纤维化的进展。本文观察银杏叶片对土三七导致的慢性肝纤维化的干预作用，报道如下。

1 实验材料

1.1 动 物 健康雌性清洁级SD大鼠42只（由浙江省医科院动物实验中心提供，许可证号：SCXK浙2008-0033），体质量180～200g，自由饮水，自然采光，室温15～25℃，予大鼠饲料喂养，实验前适应环境1周。

1.2 仪 器 日立7600-020全自动生化分析仪（株式会社日立高新技术公司），DXI800发光免疫分析仪（美国贝克曼公司），TG1650-WS高速离心机（湖南赛特湘仪），移液器（Thermo Electron公司），Olympus BHS313显微镜（奥林巴斯株式会社），PN-10AC自动照相系统（奥林巴斯株式会社），Leica RM2235普通切片机（德国徕卡仪器有限公司），Leica TEC-2500摊片机（德国徕卡仪器有限公司），Mettler AE200-S十万分之一电子天平（浙江科学器材进出口有限公司）

1.3 药品及试剂 土三七根茎（购于安徽省毫州市药材鉴定公司中药公司）；银杏叶片（批号131206，浙江康恩贝制药股份有限公司）为市售品。甲醛（上海久亿化学试剂有限公司），二甲苯（上海久亿化学试剂有限公司蒸馏水），蒸馏水（浙江海正制药厂）。

2 实验方法

2.1 土三七提取液制备[4]取土三七切片150g置煎药锅中，加入915mL蒸馏水浸泡2h，用电磁炉1000W加热煮沸，转为500W继续煎煮1.5h，滤出滤液，滤渣重新加入600mL蒸馏水，方法同上，合并滤液浓缩至150mL备用（浓度相当于1.0g土三七生药/ mL）。

2.2 银杏叶片灌胃液配制 取银杏叶片10片（相当于银杏叶片400mg）溶于12mL无菌生理盐水稀释成浓度为33.3mg/mL的灌胃液。

2.3 分 组 SD大鼠正常饲养1周后，随机分为对照组10只，模型组12只，银杏叶片低、高剂量组各10只。对照组每天按7mL/（kg·d）灌胃蒸馏水；模型组给予土三七浓缩煎液，药量7mL/kg；银杏叶片低剂量组给予土三七提取液7mL/（kg·d）+银杏叶片50mg/（kg·d）灌胃；银杏叶片高剂量组给予土三七提取液7mL/（kg·d）+银杏叶片100mg/（kg·d）灌胃。各组大鼠每日称体质量1次，按体质量变化相应调整灌胃药物剂量。模型组大鼠灌胃4周后，先处死2只，确定造模成功后，再处死全部大鼠，末次给药当晚禁食不禁水。

2.4 肝指数测定 于第4周末处死大鼠，取出肝脏，记录肝脏质量，计算肝指数（肝脏质量/体质量）。

2.5 血液指标测定 灌胃4周后摘眼球取血，分离血清，-20℃冰箱保存；用日立7600-020全自动生化分析仪测定各项肝功能指标：总胆汁酸（TBA）、白蛋白（ALB）、总胆红素（TBILI）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）等；血清透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）及IV型胶原（IV-C）等肝纤维化指标用DXI800发光免疫分析仪测定。

2.6 肝组织学检查 实验结束后选取肝左叶使用10%甲醛液固定，石蜡包埋，切片并进行HE染色，光镜下观察肝组织细胞的病理改变及肝脏纤维的增生程度。肝纤维化程度分级[5]如下，0级：无胶原纤维组织增生；I级：汇管区有少量纤维组织增生，纤维组织短而细；Ⅱ级：汇管区有较多纤维组织增生；Ⅲ级：汇管区有大量纤维组织增生，呈窄带状，并向肝小叶周围伸展；Ⅳ级：汇管区有大量纤维组织增生，呈宽带状，伸展包绕或分割肝小叶，中央静脉有偏位现象。

2.7 统计学方法 应用SPSS17.0软件，数据用均数±标准差（±s） 表示，采用单因素方差分析。

3 实验结果

3.1 各组大鼠一般情况 实验前各组SD大鼠体毛、体质量、排便、食量均正常，各组间无差异。灌胃3周后，模型组大鼠体质量明显增加，期间出现体质量先降低再增加的现象，最后大鼠出现毛发稀疏杂乱，食欲减弱，精神萎靡、少动及目眦分泌物增多，运动明显减少，剖腹可闻及恶臭味，腹腔可见少量腹水，大网膜渗出，死亡1只。银杏叶片低剂量组大鼠体质量稍增加，部分大鼠运动减少，体毛色泽稀疏，死亡1只。银杏叶片高剂量组大鼠体质量稍增加，体毛色泽稍稀疏。模型组与银杏叶片低、高剂量组体质量比较差异有统计学意义（P＜0.05）；银杏叶片低剂量组较高剂量组体质量稍有增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠体质量比较（g±s）

表1 各组大鼠体质量比较（g±s）

注：与对照组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05

组别对照组模型组银杏叶片低剂量组银杏叶片高剂量组鼠数10 11 9 10治疗前194.98±11.16 201.45±8.30 195.29±10.21 201.13±8.11治疗后228.04±12.51* 241.45±10.86▲223.90±13.27* 219.06±9.52*▲

3.2 肝指数改变 与对照组比较，模型组大鼠肝指数显著增高（P＜0.01），与模型组比较，低、高剂量银杏叶片治疗组肝指数显著降低（P＜0.05）；两治疗组比较，低剂量银杏叶片治疗组肝指数有一些上升，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肝指数比较（%±s）

表2 各组大鼠肝指数比较（%±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别对照组模型组银杏叶片低剂量组银杏叶片高剂量组鼠数10 11 9 10 肝/体质量比3.09±0.20** 3.71±0.35 3.30±0.26* 3.19±0.42*

3.3 肝功能指标检测结果 与对照组比较，模型组大鼠总胆红素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆汁酸均升高（P＜0.01），白蛋白下降（P＜0.01）。与模型组比较，银杏叶片高剂量组总胆红素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆汁酸均显著下降（P＜0.01）、白蛋白上升（P＜0.05）；银杏叶片低剂量组总胆红素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶均下降（P＜0.05）、白蛋白上升（P＜0.05），但总胆汁酸下降不明显（P＞0.05）。银杏叶片高、低剂量组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 各组大鼠肝功能比较（±s）

表3 各组大鼠肝功能比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；TBILI：总胆红素；ALT：谷丙转氨酶；AST：谷草转氨酶；ALB：白蛋白；TBA：总胆汁酸

/L）ALT（U/L）AST（U/L）组别对照组模型组银杏叶片低剂量组银杏叶片高剂量组鼠数10 11 9 10 TBIL（μmol 1.32±0.65** 6.02±1.26 2.43±1.00** 2.28±0.55** 60.50±3.60** 143.54±23.25 117.44±35.24* 98.13±13.50** 143.40±18.13** 303.92±51.53 220.44±48.13* 198.20±41.64** ALB（g/L）34.47±1.10** 29.08±3.62 31.95±1.64* 32.48±1.33* TBA（μmol/L）23.35±5.18** 55.47±12.16 42.04±22.83 33.50±7.70**

3.4肝纤维化指标 与对照组比较，模型组透明质酸、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原等均明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，银杏叶片组透明质酸、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原等均有不同程度的降低，高剂量银杏叶片组指标下降更明显（P＜0.01）；银杏叶片高、低剂量组间比较，Ⅳ型胶原差异有统计学意义（P＜0.05），其余无显著差异。见表4。

表4 各组大鼠肝纤维化指标比较（ng/mL±s）

表4 各组大鼠肝纤维化指标比较（ng/mL±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与低剂量组比较，△P＜0.05；HA：透明质酸；PCⅢ；Ⅲ型前胶原；IV-C：IV型胶原

组别对照组模型组银杏叶片低剂量组银杏叶片高剂量组只数10 11 9 10 HA 106.44±8.32** 189.72±23.30 157.80±41.63* 162.63±13.48** PCⅢ7.63±0.67** 20.50±4.52 16.26±2.86* 14.40±1.73** IV-C 2.50±0.36** 3.86±0.94 3.16±0.76 2.58±0.36**△

3.5 肝组织病理学检测 苏木精—伊红染色标本法观察肝组织病理学变化发现：对照组大鼠拥有结构完整的肝小叶，肝脏表面水润有光泽，肝细胞以中央静脉为中心，向四周略呈放射状排列，模型组大鼠肝小叶结构不同程度的破坏，肝细胞变性、坏死，中央静脉内皮细胞受损、脱落，管腔变形狭窄，肝窦淤血、狭窄、闭塞，肝纤维化范围较广，呈片状分布，部分肝细胞脂肪变性导致中央静脉狭窄。银杏叶片低剂量组HE染色主要表现为大部分肝小叶结构尚完整，局灶肝小叶结构破坏，部分肝区可见肝窦狭窄，汇管区纤维组织增生明显，假小叶形成，但较模型组症状轻，银杏叶片高剂量组大鼠肝脏肝小叶结构完整，部分区肝细胞脂肪变性，可见散在的肝窦淤血及内皮细胞损伤，汇管区纤维组织增生形成小的条索，尚未形成间隔改建肝小叶结构（见封三图1）。

4 讨 论

HVOD是一种棘手的肝脏病变，病因可能与服用烷化剂类化疗药、吡咯类生物碱类植物（如狗舌草、土三七中毒可引起静脉内膜炎、静脉纤维性改变）[6-7]和放射线照射有关。近几年由于癌症高发，放化疗增多，HVOD患者越来越多。有关HVOD治疗药物的筛选、开发成为国际医学领域研究的热点[8-9]。

银杏叶片具有改善心、肝、肺、脑等脏器的缺血再灌注损伤作用；对肝细胞的损伤、肝纤维化、肝硬变、肝癌亦有一定的治疗作用，本实验HVOD大鼠建立模型经过预实验筛选后，确定浓缩土三七灌胃剂量为7g/kg。

本实验结果显示，银杏叶片50mg/（kg·d）、100mg/（kg·d），干预后各组HVOD模型大鼠的体毛、体质量、食量、活动度等一般情况明显好于模型组，且无大鼠出现腹水。大鼠AST、ALT、TBIL、HA、PCⅢ、IV-C等临床和实验室指标较模型组均有很大改善。与银杏叶片50mg/（kg·d）治疗组比较，银杏叶片100mg/（kg·d）组大鼠肝功能、肝纤维化指标结果更接近于对照组，且Ⅳ型胶原指标差异有统计学意义（P＜0.05）。

病理学显示，土三七诱导大鼠成HVOD模型10只，以病理改变中度为主，肝小叶结构不同程度的破坏，肝细胞变性、坏死，肝窦淤血、扩张，肝纤维化范围较广；银杏叶片各剂量组大鼠发生慢性HVOD较少，银杏叶片100mg/（kg·d）治疗组6只大鼠出现轻度HVOD，肝纤维化不明显；银杏叶片50mg/（kg·d）治疗组5只成模，且病理改变多以轻、中度为主，其中两只大鼠出现中度肝纤维化，肝窦狭窄、淤血明显，但病变程度较模型组减轻，说明银杏叶片对HVOD发生有一定防治作用，可减少肝纤维化的发生。

［1］周燕萍，孙李建，于珊珊，等.土三七引起肝静脉闭塞性疾病并致死亡［J］.药物不良反应杂志，2012，14（5）：327-328.

［2］徐静，汪茂荣.土三七导致肝小静脉闭塞综合征研究进展［J］.实用肝脏病杂志，2013，16（1）：94-96.

［3］李婉儿，陈芝芸，严茂祥，等.银杏叶提取物对肝纤维化大鼠肝脏血小板衍生生长因子表达的影响［J］.浙江中西医结合杂志，2013，23（5）：339-341.

［4］宋宇，禹铮，樊艳华，等.土三七水煎剂所致肝小静脉闭塞病大鼠模型的建立［J］.临床肝胆病杂志，2011，27（8）：860-864.

［5］DeLeve LD，McCuskey RS，Wang X，et al.Characterization of a reproducible rat model of hepatic veno-occlusive disease ［J］.Hepatology，1999，29（6）：1779-1791.

［6］Chen MY，Cai JT，Du Q，et al.Reliable experimental model of hepatic veno-occhsive disease caused by monocrotaline ［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2008，7（4）：395-400.

［7］Chen Z，Huo JR.Hepatic veno-occlusive disease associated with toxicity of pyrrolizidine alkaloids in herbal preparations ［J］.Neth J Med，2010，68（6）：252-260.

［8］陈哲，霍继荣，朱洪怡，等.川芎嗪对土三七诱导的肝小静脉闭塞病小鼠肝组织PAI-1表达的影响［J］.中国医科大学学报，2012，41（8）：709-712.

［9］杨丽，霍继荣，朱洪怡，等.丹参对土三七诱导小鼠肝小静脉闭塞病预防治疗效果的观察［J］.肝脏，2013，18（2）：105-107.

（收稿：2015-10-05 修回：2015-12-18）

Effect of Ginkgo Biloba Tablets on Gynura Segetum-induced Hepatic Veno-occlusive Disease in Rats

XULijun,CHEN Saizhen,XU Hongyan,LIN Lifen,TIAN Ziyou,CAO Xuequan,CHEN Wenju.Department of Pharmacy,Taizhou Central Hospital,Taizhou(318000),China

ObjectiveTo investigate the effects of Ginkgo biloba tablets on Gynura segetum-induced hepatic veno-occlusive disease in rats.MethodsForty-two female SD rats were randomly divided into 4 groups:control group（n=10）,model group（n=12）,low-dose and high-dose Ginkgo prophylaxis groups（n=10）.Control group was given distilled water.Model group was given Gynura segetum water decoction（7mL·kg-1·d-1）.Ginkgo prophylaxis groups received a mixture of gynura segetum water decoction（7mL·kg-1·d-1）and ginkgo biloba（50 or 100mg·kg-1·d-1）. All rats were sacrificed 4 weeks later to collect blood and liver samples.Serum biochemistry parameters were measured,the liver collagen expression and fibrosis were evaluated by using eosin（HE）staining.ResultsGinkgo prophylaxis groups showed decreased TBIL,ALT,AST,HA,and PCIII compared with model group（TBILI:2.43± 1.00μmol/L,2.28±0.55μmol/L vs 6.02±1.26μmol/L;ALT:117.44±35.24U/L,98.13±13.50U/L vs 143.54±23.25U/L; AST:198.20±41.64U/L,220.44±48.13U/L vs 303.92±51.53U/L;HA:157.80±41.63ng/mL,162.63±13.48ng/mL vs 189.72±23.30ng/mL;PCIII:16.26±2.86ng/mL,14.40±1.73ng/mL vs 20.50±4.52ng/mL;all P＜0.05）.The level of ALB was higher in Ginkgo biloba prophylaxis group than that in model group（31.95±1.64g/L,32.48±1.33g/L vs 29.08± 3.62g/L,P＜0.05）.IV collagen in high-dose Ginkgo biloba prophylaxis group was lower than that in low-dose Ginkgo biloba prophylaxis group（2.58±0.36ng/mL vs 3.16±0.76ng/mL,P＜0.05）.The pathological examination showed liver fibrosis decreased in both Ginkgo biloba prophylaxis groups,especially in high-dose group.ConclusionGinkgo biloba tablets have effect on prevention of HVOD-induced by Gynura segetum in rats.

rats;hepatic veno-occlusive disease;Ginkgo biloba tablets;Gynura segetum

浙江台州恩泽医疗中心集团课题立项（No.11EEC10）

浙江省台州市中心医院药剂科（徐利君、陈赛贞、徐红燕、林利芬、田自有）、病理科（曹学全）、检验科（陈文举）（台州 318000）

徐利君，Tel：（0516）88551679；E-mail：xulijun_1985@163.com