自噬在丹参酮ⅡA减轻内毒素性急性肺损伤中的作用及相关机制研究

周炜栋杨蒙召陈 晔

·实验研究·

自噬在丹参酮ⅡA减轻内毒素性急性肺损伤中的作用及相关机制研究

周炜栋1杨蒙召1陈 晔2

目的探讨自噬在丹参酮ⅡA减轻内毒素性急性肺损伤中的作用及相关机制。方法将32只SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型组、丹参酮ⅡA组和3-MA组（自噬抑制组）。通过气管内滴入0.05%内毒素（LPS）溶液0.02mL建立大鼠急性肺损伤模型及腹腔预注射自噬抑制剂3-MA（15mg/kg）或丹参酮ⅡA（1mL/kg·d）后摘取肺组织，免疫组化法检测肺组织病理改变，ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-10水平，Western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及泛素相关蛋白SQSTM1/ P62水平。结果免疫组化示模型组肺泡间隔增厚，肺泡腔狭窄，大量炎症细胞渗出；丹参酮IIA组则明显改善；3-MA组抑制自噬后肺泡炎症细胞渗出明显。与对照组比较，模型组LC3-Ⅱ灰度值明显升高（4954.39±433.62比2408.66±250.12，P＜0.05），SQSTM1/P62灰度值下降（2316.21±274.71比4176.72±422.05，P＜0.05），炎症因子TNF-α[（11.00±1.43）pg/mL比（3.30±0.75）pg/mL、IL-6（41.89± 8.82）pg/mL比（21.89±2.83）pg/mL、IL-10（91.34±16.94）pg/mL比（28.15±6.91）pg/mL]浓度升高（P均＜0.05）；与模型组比较，丹参酮IIA组LC3-Ⅱ灰度值显著升高（6064.37±552.26比4954.39±433.62，P＜0.05），SQSTM1/P62灰度值下降（1233.33±143.72比2316.21±274.71，P＜0.05），炎症因子[TNF-α （8.98±1.27）pg/mL比（11.00±1.43）pg/mL、IL-6（33.07±5.15）pg/mL比（41.89±8.82）pg/mL、IL-10 （59.76±19.25）pg/mL比（91.34±16.94）pg/mL]浓度下降（P均＜0.05）；与丹参酮IIA比较，3-MA组LC3-Ⅱ灰度值下降（1558.71±177.16比6064.37±552.26，P＜0.05），SQSTM1/P62升高（4360.06± 464.31比1233.33±143.72，P＜0.05），炎症因子[TNF-α（11.08±1.58pg）/mL比（8.98±1.27）pg/mL、IL-6 （39.87±5.13）pg/mL比（33.07±5.15）pg/mL、IL-10（77.52±9.28）pg/mL比（59.76±19.25）pg/mL]浓度升高（P均＜0.05）。结论丹参酮ⅡA可能通过增强内毒素性急性肺损伤大鼠的自噬水平，减轻内毒素性急性肺损伤。

大鼠；自噬；丹参酮ⅡA；内毒素；急性肺损伤；炎症因子

内毒素所致急性肺损伤（acute lung injury，ALI）[1]是呼吸系统常见的危重症。丹参酮ⅡA是中药丹参的主要活性成分，具有抗凝、抗炎、抗黏附作用[2]。研究[3]表明，丹参酮ⅡA对急性肺损伤具有保护作用。自噬（autophagy）是细胞内可溶性的大分子物质（如核酸，蛋白质，碳水化合物和脂质）及功能失调的细胞器（如线粒体，核糖体，过氧化物酶体和内质网）高度保守的非特异性降解过程[4]。微管相关后自轻链3 （LC3）是自噬相关基因（autophagy-related gene，ATG）8表达的产物,分为Ⅰ型和Ⅱ型。当自噬发生时，Ⅰ型经泛素样修饰与磷脂酰乙醇胺结合，定位于自噬体膜上，形成LC3-Ⅱ，其被认为是自噬体的标志分子。P62是由原癌基因c-myc编码的蛋白，当自噬发生时，P62与泛素化蛋白结合，再与自噬体膜上的LC3-Ⅱ蛋白形成复合物，并被运送至自噬溶酶体中降解，因此，当自噬发生时，P62水平下降；自噬受抑制时，P62水平增高。文献[5-6]报道，自噬可以清除病理性炎症反应产物从而减轻其对细胞或细胞器的损伤。本研究探讨自噬在丹参酮ⅡA减轻内毒素性急性肺损伤中的作用及相关机制。

1 实验材料

1.1 动 物 清洁级SD大鼠32只，雄性，体质量（210±15）g，浙江中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：X10C2168。所有SD大鼠分笼饲养，标准规格的啮齿类食物喂养，自由饮水，室内温度控制在（21±2）℃，湿度控制在（55±2）%。

1.2 材 料 内毒素（LPS）、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）购自美国 Sigma公司（批号20140121，20130809）；抗LC3-Ⅱ多克隆抗体购自美国Novus公司（NB600-1384）；GAPHD、SQSTM1/p62抗体购自美国CST公司（批号20131204，20130913）；TNF-α、IL-6、IL-10酶联免疫吸附实验（ELISA）检测试剂盒购自美国R&D公司（批号20140112，20131109，20131211）；丹参酮ⅡA磺酸钠注射液购自上海第一生化药业有限公司（批号20140305）。

2 实验方法

2.1 分组及模型制备 将32只实验用清洁级SD大鼠编号后按随机数字表法随机分为四组：正常对照组；模型组：参照文献[6]方法，在大鼠气管内滴入0.05%的LPS溶液0.02mL；丹参酮IIA组：在内毒素性急性肺损伤造模后连续7天给予大鼠腹腔注射1mL/（kg·d）的丹参酮ⅡA磺酸钠注射液；3-MA组（自噬抑制组）：在建立内毒素性急性肺损伤模型前30min先给予大鼠腹腔注射15mg/kg的自噬抑制剂（3-MA），造模后连续7天再给予大鼠腹腔注射1mL/ （kg·d）的丹参酮ⅡA磺酸钠注射液。

2.2 免疫组化 4%多聚甲醛固定取下的肺组织，用梯度乙醇溶液进行脱水后石蜡包埋，切片。二甲苯60℃ 20min脱蜡，梯度乙醇溶液水化后烘干、苏木精-伊红（HematoxylinEosin，HE）染色，光镜下观察各组大鼠肺病理组织形态学改变。

2.3 蛋白免疫印迹（Western blot）检测LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62表达 取适量肺组织，加入液氮后在撵钵中撵成粉末，倒入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液

3 实验结果

3.1 丹参酮ⅡA及自噬对LPS诱导的大鼠急性肺损伤的保护作用 免疫组化显示，对照组大鼠肺组织结构正常，肺泡结构清晰；模型组肺泡间隔明显增厚，肺泡腔狭窄，腔内可见出血及大量炎症细胞浸润。内毒素LPS成功诱导了大鼠急性肺损伤。丹参酮ⅡA组免疫组化显示大鼠肺泡结构趋于正常，肺泡腔出血减少，炎症细胞浸润减轻。与丹参酮ⅡA组比较，3-MA组（自噬抑制组）各种肺损伤表现严重：肺泡腔明显狭窄，出血增多，腔内可见大量炎症细胞的浸润（插页图1）。

3.2 四组大鼠LC3-Ⅱ、SQSTM1/P62表达量比较

蛋白免疫印迹分析自噬相关蛋白的表达情况，与对照组比较，模型组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达量增加（P＜0.05），SQSTM1/p62表达降低（P＜0.05），自噬水平增强；与模型组比较，丹参酮ⅡA组LC3-Ⅱ表达量升高（P＜0.05），SQSTM1/p62明显降低（P＜0.05），自噬水平进一步增强；与丹参酮ⅡA组比较，3-MA组（自噬抑制组）LC3-Ⅱ表达量降低（P＜0.05），SQSTM1/p62表达升高（P＜0.05），自噬水平下降。见表1-2、图2（插页）。

3.3 四组大鼠血浆炎症因子表达比较 与对照组比较，模型组大鼠血浆TNF-α、IL-6、IL-10表达量明显增多（P均＜0.05）；丹参酮ⅡA组TNF-α、IL-6、IL-10表达量较模型组下降（P均＜0.05）；3-MA组（自噬抑制组）TNF-α、IL-6、IL-10表达较丹参酮ⅡA组增加（P均＜0.05）。见表3。中在冰上裂解30min，每隔10min震荡1次，13 300r/ min离心12min后取上清液，BCA法进行蛋白定量。样本中加入5×loading上样缓冲液并等体积补水后置于电饭锅内煮沸7min。每个样本取60μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，跑完后转印至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭2h，在4℃冰箱中分别孵育GAPDH、LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62抗体过夜。TBS-T洗3次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2h，ECL法显影并在富士LAS-4000曝光机上读取图像。

2.4 ELISA检测血浆TNF-α、IL-6、IL-10水平 采用酶联免疫吸附法检测，步骤按说明书进行。

表1 四组大鼠LC3-Ⅱ表达量比较（±s）

表1 四组大鼠LC3-Ⅱ表达量比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与丹参酮ⅡA组比较，▲P＜0.05

只数组别对照组模型组丹参酮ⅡA组3-MA组3 3 3 3 LC3-Ⅱ2408.66±250.12 4954.39±433.62* 6064.37±552.26△* 1558.71±177.16▲GAPDH 6984.45±704.34 5701.04±565.32 5577.45±585.53 8354.62±755.11 LC3-Ⅱ/GAPDH 0.345 0.869 1.087 0.186

表2 四组大鼠P62表达量比较（±s）

表2 四组大鼠P62表达量比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与丹参酮ⅡA组比较，▲P＜0.05

组别对照组模型组丹参酮ⅡA组3-MA组只数3 3 3 3 P62 4176.72±422.05 2316.21±274.71* 1233.33±143.72△4360.06±464.31▲GAPDH 6667.73±697.59 8006.09±778.38 7284.35±688.18 7407.54±783.28 P62/GAPDH 0.626 0.289 0.169 0.589

表3 各组炎症因子表达比较（pg/mL±s）

表3 各组炎症因子表达比较（pg/mL±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与丹参酮ⅡA组比较，▲P＜0.05

IL-10 28.15±6.91 91.34±16.94* 59.76±19.25*△77.52±9.28▲组别对照组模型组丹参酮ⅡA组3-MA组只数8 8 8 8 TNF-α 3.30±0.75 11.00±1.43* 8.98±1.27*△11.08±1.58▲IL-6 21.89±2.83 41.89±8.82* 33.07±5.15*△39.87±5.13▲

4 讨论

内毒素所致急性肺损伤的主要机制是内毒素活化多条细胞内的炎症信号传导通路[7]引起各种炎症因子和炎症介质的过度释放,机体促炎与抗炎反应失平衡后大量炎症细胞、炎症因子和炎症介质聚集和浸润于肺部[8]，常导致肺血气交换异常，换气功能减退的病理过程，治疗不及时可发展成为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）[9]甚至呼吸衰竭。丹参的主要成分丹参酮ⅡA对内毒素致炎症细胞释放高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein，HMGB1）[10]具有明显的抑制作用，HMGB1一旦分泌到细胞外，即可发挥致炎作用[11]，因此丹参酮ⅡA可以通过调节促炎和抗炎因子平衡减轻炎症介导的肺组织损害，在一定程度上缓解内毒素性急性肺损伤的发生发展。此外，目前认为内毒素的主要成分脂多糖可以诱导增强自噬水平[12]，而自噬可以通过清除已发生过度炎症损伤或功能异常的细胞或细胞器[13]，从而保护正常的肺功能。

本研究结果显示，模型组大鼠肺组织与对照组相比，肺泡间隔明显增厚，肺泡腔狭窄，腔内可见出血及大量炎症细胞浸润。免疫印迹表明，模型组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达增强，SQSTM1/p62减弱，丹参酮ⅡA进一步增强了急性肺损伤组织自噬水平。增强的自噬水平可能在丹参酮ⅡA减轻内毒素性急性肺损伤中具有保护作用。随后的Elisa检测结果亦显示丹参酮ⅡA组较模型组炎症水平减弱，而抑制自噬炎症表达增强。

实验结果显示，丹参酮ⅡA可能通过调节炎症水平，抑制炎症因子、炎症介质的释放[14]，减轻内毒素性急性肺损伤的程度。自噬一方面可以降解因炎症反应死亡或受损的细胞或细胞器等并重新利用，以维持细胞稳态。另一方面，自噬信号通路参与调控免疫应答和控制过度炎症反应中也发挥着重要作用[15-16]：自噬通过与I型干扰素信号通路、TLR信号通路和炎性体之间的相互作用限制过度的炎性反应，保护正常的肺组织，减轻内毒素性急性肺损伤。

［1］Xiao M，Zhu T，Zhang W，et，al.Emodin ameliorates LPS-induced acute lung injury，involving the inactivation of NF-kappaB in mice［J］.Int J MolSci，2014，15（11）：19355-19368.

［2］沈琪琦，张之龄，朱健，等.丹参酮对脂多糖性急性肺损伤大鼠肺组织ACE2表达的影响［J］.临床急诊杂志，2011，12（3）：161-165.

［3］许敏，李志超，董明清，等.丹参酮IIA磺酸钠对脂多糖致小鼠急性肺损伤的预防与治疗作用及其机制［J］.中国药理学通报，2008，24（4）：477-481.

［4］ Wen Z，Fan L，Li Y，et al.Neutrophils counteract autophagy-mediated anti-inflammatory mechanisms in alveolar macrophage:role in posthemorrhagic shock acute lung inflammation［J］.J Immunol，2014，193（9）：4623-4633.

［5］Hu Y，Liu J，Wu YF，et al.mTOR and autophagy in regulation of acute lung injury：a review and perspective［J］. Microbes Infect，2014，16（9）：727-734.

［6］Bailey KL，Romberger DJ，Katafiasz DM，et，al.TLR2 and TLR4 Expression and Inflammatory Cytokines are Altered in the Airway Epithelium of Those with Alcohol Use Disorders［J］.Alcohol ClinExp Res，2015，21（18）：27-34.

［7］詹丽英，李文澜，柯伟，等.内毒素急性肺损伤中p38MAPK、NF-κB与HO-1的关系［J］.中国病理生理杂志，2010，26 （9）：1790-1795.

［8］黄晗，赵二要.急性肺损伤/呼吸窘迫综合征肺功能变化的临床研究［J］.中国社区医师（医学专业），2013，15（1）：64-65.

［9］Wang G，Liu L，Zhang Y，et al.Activation of PPARgamma attenuates LPS-induced acute lung injury by inhibition of HMGB1-RAGE levels［J］.Eur J Pharmacol，2014，726（8）：727-732.

［10］李一龙，李蕾，王发龙，等.丹参酮ⅡA抑制脂多糖诱导后巨噬细胞HMGB1的释放［J］.中华中医药杂志，2011，26（9）：2059-2061.

［11］Wang J，Feng X，Zeng Y，et，al.Lipopolysaccharide（LPS）-induced autophagy isinvolved in the restriction of Escherichia coli in peritoneal mesothelialcells［J］.BMC Microbiol，2013，13（1）：255-258.

［12］Huang YH，Al-Aidaroos AQ，Yuen HF，et al.A role of autophagy in PTP4A3-driven cancer progression［J］.Autophagy，2014，10（10）：1787-800.

［13］吴琳，张旋，王殿华.灯盏花素肺部给药抗大鼠急性肺损伤氧化作用的研究［J］.昆明医学院学报，2009，12（4）：22-26.

［14］郭伟强，曹婷婷，徐雯婧，等.丹参酮Ⅱ-A对细胞因子IL-6和IL-10的影响［J］.生物技术，2008，18（6）：30-32.

［15］Pan H，Zhang Y，Luo Z，et al.Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways［J］.Am J Physiol Lung Cell MolPhysiol，2014，306（2）：183-195.

［16］Bachetti T，Ceccherini I.Tumor necrosis factor receptorassociated periodic syndrome as a model linking autophagy and inflammation in protein aggregation diseases ［J］.J Mol Med（Berl），2014，92（6）：583-594.

（收稿：2015-09-10 修回：2015-12-20）

Beneficial Effects of Autophagy in Tanshinone IIA Reducing Endotoxin-induced Acute Lung Injury And Its Related Mechanisms

ZHOU Weidong1,YANG Mengzhao1,CHEN Ye2. 1Department of Respiratory Diseases,County Chinese Medical Hospital of Pingyang Zhejiang,Wenzhou(325401),China;2Department of Respiratory Diseases,Xinhua Hospital of Zhejiang,Hangzhou(310005),China

ObjectiveTo investigate the effect of autophagy in Tanshinone IIA reducing endotoxin-induced acute lung injury in rats and the underlying mechanism.MethodsThirty-two rabbits were randomly divided into 4 groups（n=8）:control group,acute lung injury model group,tanshinone IIA group,and autophagy inhibition group. Except for control group,rats in other groups were intratracheally given 0.02 mL of 0.05%lipopolysaccharide to establish the model of acute lung injury,then tanshinone IIA group and autophagy inhibition group were treated with intraperitoneal injection of tanshinone IIA（1mL·kg-1·d-1）and autophagy inhibitor 3-MA（15mg/kg）,respectively.After the treatment,lung tissue in each group were extracted for immunohistochemistry and the detection of TNF-α,IL-6,and IL-10 with ELISA and the measurement of autophagy related protein LC3-II and SQSTM1/P62 with Western blotting.ResultsHistopathologic examination showed edematous changes of thickening of alveolar walls, narrowed alveolar,and massive polymorphonuclear infiltration in model group.These changes in tanshinone IIA group were significantly alleviated,however,after 3-MA inhibited autophagy,obvious polymorphonuclear infiltration were observed.Compared with control group,the level of autophagy associated protein LC3-Ⅱincreased（4954.39± 433.62 vs 2408.66±250.12,P＜0.05）and SQSTM1/P62 decreased（2316.21±274.71 vs 4176.72±422.05,P＜0.05）and the levels of TNF-α（11.00±1.43pg/mL vs 3.30±0.75pg/mL）,IL-6（41.89±8.82pg/mL vs 21.89±2.83pg/mL）,IL-10 （91.34±16.94pg/mL vs 28.15±6.91pg/mL）increased in acute lung injury model group（all P＜0.05）.After the treatment of tanshinone IIA,the level of LC3-Ⅱ increased（6064.37±552.26）,SQSTM1/P62 decreased（1233.33±143.72）and the levels of TNF-α（8.98±1.27pg/mL）,IL-6（33.07±5.15pg/mL）,and IL-10（59.76±19.25pg/mL）decreased （compared with acute lung injury model group,all P＜0.05）.However,compared with tanshinone IIA group,the level of LC3-Ⅱin autophagy inhibition group decreased（1558.71±177.16）,SQSTM1/P62 increased（4360.06±464.31）, and the levels of TNF-α（11.08±1.58pg/mL）,IL-6（39.87±5.13pg/mL）,IL-10（77.52±9.28pg/mL）increaesed（all P＜0.05）.ConclusionTanshinone IIA can enhance the level of autophagy in endotoxin-induced acute lung injury,resulting in reduction of the injury.

rats;autophagy;tanshinone IIA;endotoxin;acute lung injury;inflammatory cytokines

国家自然科学基金青年项目（No.81302935）

1浙江省平阳县中医院呼吸内科（温州 325401）；2浙江省新华医院呼吸内科（杭州 310005）

陈晔，Tel：13588489515；E-mail：chenye1375@sina.com