HBV前S/S基因突变的研究进展

卢姗姗，徐东平，李 进



HBV前S/S基因突变的研究进展

卢姗姗，徐东平，李 进

[摘要]HBV前S/S区基因突变可以是自发的，也可以是外界压力选择的结果。突变株可通过输血、器官移植、分娩等造成HBV感染，也可以引起急性、慢性和隐匿性HBV感染。HBV前S/S基因突变可导致病毒生物学特点和免疫应答发生改变，引起免疫逃逸、疫苗预防失败、HBsAg阴性感染和疾病重症化等，与肝硬化和肝癌的进展也有密切关系，从而影响HBV慢性感染的临床转归。

[关键词]乙型肝炎病毒；基因型；突变；疾病恶化

[作者单位] 541004 ，桂林医学院研究生院（卢姗姗）；100039 北京，解放军第三〇二医院临床研究管理中心（徐东平），医务部（李进）

自从1992年乙型肝炎（乙肝）疫苗的广泛接种以及多种抗病毒药物的使用，虽然使HBV感染率呈现下降趋势，但在世界范围内HBV感染仍然是一个重要的公共健康问题。中国作为HBV感染率较高的国家，这一问题尤为严重。HBV慢性感染可以引起不同的临床表现，包括无症状携带（免疫耐受期）、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化（liver cirrhosis, LC）、肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）以及隐匿性HBV感染（occult HBV infection, OBI）。临床上血清中HBsAg和HBsAb同时阳性的患者并不少见，另有少数HBsAg阴性、HBsAb阳性的患者血清中也能检测到HBV DNA的存在，甚至在免疫预防的人群中也出现了HBV感染，包括接受乙肝疫苗者、HBsAg阴性肝移植受者和免疫球蛋白阻断母婴传播的婴儿。研究表明 HBV前S/S基因突变是引起上述现象的主要机制之一，尤其是当突变发生在HBV S基因的主要亲水区域（major hydrophilic region，MHR；aa 99-169）内时可引起抗原性的明显改变，还发现前S/S基因突变与肝脏疾病进展为LC和HCC也有相关性[1]。我们就近年来在此方面的研究进展，结合本课题组的工作，对HBV前S/S基因的结构和功能、基因突变特点、突变的临床意义以及相关应对措施综述如下。

1　前S/S基因的结构及功能

HBV基因组含有4个开放读码框区：前S/S区、前C/C区、P区和X区。其中前S/S基因主要包括前S1区基因、前S2区基因和S区基因，在起始端均有各自的起始密码子，但共用同一个终止密码子。前S/S基因主要编码3种不同的、结构相关的包膜蛋白：大、中、小蛋白。S区包含226个氨基酸，编码小蛋白即HBsAg，是病毒包膜蛋白的主要抗原区域，是中和抗体的主要识别位点，此区域发生变异，病毒的抗原性和免疫原性将可能发生显著改变。前S2区由55个氨基酸组成，前S1区因基因亚型的不同而造成长度不固定，由108或119个氨基酸构成，此区域包含与肝细胞结合受体牛磺胆酸共转运多肽的结构域[2]，在病毒感染进入细胞中起重要作用。前S/S基因除了编码包膜蛋白与病毒基因形成病毒颗粒外，还形成大量不含病毒核酸亚颗粒释放到血清中。此外，S基因与P基因的反转录酶（reverse transcriptase, RT）区重叠，因此抗病毒药物治疗导致某些RT基因耐药突变会引起S区基因对应位点的错义或无义突变。

2　前S/S区基因突变特点

HBV在复制过程中需要的DNA聚合酶缺乏校正功能，导致HBV出现高突变率，在宿主压力、疫苗和免疫球蛋白预防以及抗病毒药物的外界压力下对环境适应性较强的HBV突变株将选择性地成为优势株。HBV突变可改变蛋白的构象及功能，进而影响HBV感染的临床表现特点。研究显示改变了病毒生物特点的突变株与病毒性肝脏疾病的发生发展有密切的关系[1,3]。HBV突变并不是平均分布在整个基因组中，在某个特定的区域内更加常见，如BCP区/前C区和前S/S区[4]。由于前S/S蛋白具有强免疫原性，因此在机体的免疫压力下前S/S基因容易发生突变。关于前S区突变的报道大多与T细胞、B细胞表位的缺失有关，前S大片段缺失突变还可引起HBsAg表达或分泌水平的显著降低，因此可能会造成HBV发生免疫逃逸[5]。针对HBsAb出现的免疫逃逸突变主要位于S区的MHR，尤其是“a”决定簇（aa 124-147）内，该区域发生突变可能会导致HBsAg构象发生改变并影响其抗原性和免疫原性，引起免疫逃逸，如最经典的G145R突变[6]。有研究表明在HBsAg和HBsAb同时阳性的患者样本中，前S区基因缺失突变伴随S区基因点突变的检出率较高，可引起较强的免疫逃逸，推测是免疫压力选择的结果[7]。

3　前S/S基因突变的意义

3.1与LC和HCC发生的关系 众多研究显示HBV前S/S基因突变与HCC的发生发展有密切的关系[8-10]。我们课题组近期通过大量临床样本筛查也发现，在HBV感染的疾病进程中，前S缺失突变的检出率呈现一个明显递增的趋势，在LC阶段前S1缺失突变显著增多，而前S2缺失突变在HCC中明显升高，因此我们推测前S基因缺失突变可能促进了肝脏疾病的进展[11]。相关数据也显示了前S突变在HCC发病机制中潜在的作用[12-14]。普遍认为前S基因突变可以使包膜蛋白比例失调，在内质网中生产过剩和堆积，增加了内质网压力，导致内质网应激引起细胞内活性氧族增加，造成DNA氧化损伤和基因的不稳定性，促进HCC的发生发展[13,15]。同时，堆积了突变蛋白的毛玻璃样肝细胞也被认为是HCC的前期病变的基础[12]。此外，前S2蛋白可直接作用于Jun活化结构域-连接蛋白1，导致细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p27降解和细胞周期发生变化[16]，也可通过细胞周期蛋白A和环氧合酶-2的过表达，从而影响细胞周期的进程，促进细胞增殖和贴壁不依赖性生长，进而促进LC和HCC的发生[17]。此外，前S基因缺失和起始密码子突变也可通过降低S抗原水平，影响机体免疫清除导致病程隐匿发展，增加了LC 和HCC的发生风险。

在宿主和抗病毒治疗压力下，S区基因某种特殊的突变也可潜在影响HCC的进展。研究显示在产生拉米夫定耐药的患者中HCC的发生率要高于未使用核苷类药物的人群[18]。长期使用拉米夫定抗病毒治疗容易发生药物选择压力导致的耐药突变，其中RT区A181T突变可同时引起S基因的W172位点提前终止，导致表面蛋白C末端疏水区域缺失55个氨基酸，出现S截断蛋白，影响病毒分泌并激活癌基因启动子，随访观察到A181T/ sW172*突变患者较未突变患者HCC发生率显著增高，从而提示该突变对HCC的发展有一定促进影响[19-20]。核苷类药物抑制病毒复制但并不直接作用于S基因转录和S蛋白分泌，HBV的致癌性可能与表面蛋白在细胞内堆积引起的氧化应激有关，而突变的S蛋白在内质网中生产过剩和滞留，增加了HCC的发生风险[3]。

3.2与OBI发生的关系 血清中HBsAg阳性是诊断HBV感染的基本指标，但是在少数HBsAg阴性的患者血清中或肝组织中也能检测到HBV DNA，这种状态被称为OBI[21]。OBI的发病机制尚未完全阐明，但是值得重视的是部分OBI是由于HBV前S/S基因发生了针对HBsAb产生的免疫逃逸突变引起的。我们课题组近期对多例比较特殊的OBI患者进行了动态跟踪，发现患者体内存在多种HBV 前S/S突变株，其中在1例患者中发现多种新的突变或联合突变，包括前S1基因片段缺失突变、前S2起始密码子突变、S基因MHR的点突变和插入突变。在HBV突变中，包括a决定簇点突变和新增N-糖基化位点突变等，证实前S1基因大片段缺失显著降低HBsAg表达水平，S基因MHR区的某些突变可显著降低HBsAg的抗原性，提示前S/S基因突变是患者发生OBI的原因[22]。我们发现，携带某些S基因突变的OBI患者常有低水平HBsAb，提示这些突变可能诱导产生低水平的抗体干扰了试剂检测。我们在陕西省宝鸡市血液中心获得60份疑似OBI血清样本，采用巢式PCR扩增其前S/S区基因后发现大部分序列均存在不同形式不同位点突变。Kim等[23]认为S区基因突变，尤其是MHR区内的突变，不仅影响S蛋白的抗原性，而且影响病毒和S蛋白的分泌，引起OBI的发生。HBsAg是HBsAb主要的识别位点，也是疫苗的作用靶点，此区域基因发生变化，可以降低HBsAg的抗原性，甚至导致商业性的HBsAg检测试剂对突变株HBsAg无法识别，引起HBsAg出现阴性结果。Yu等[24]发现在HBsAg和抗HBsAg双阳性的患者中，S基因MHR区新增N-糖基化位点突变检出率显著增高，此类突变可显著降低HBsAg的抗原性，干扰HBsAb的识别，并增加病毒分泌能力。另有研究报道前S缺失突变可通过影响HBV的基因型和HBsAg表达导致OBI的发生[25]。

3.3引起临床免疫预防失败 一般来说，接种乙肝疫苗后诱导产生的HBsAb可以识别和清除HBV，预防HBV的感染。理论上，HBsAg与HBsAb通常处于动态平衡中，即HBsAb在HBsAg转阴后几周，经过一段时间才会在血清中被检测到，也就是说两者通常不应在血清中同时出现。但在临床实践中，一些慢性HBV感染者血清中可检测到HBsAg和HBsAb同时阳性，且近年来随着检测方法灵敏度的提高，这种现象明显增多[26]。有研究表明这种现象有的与HBsAg发生免疫逃逸突变相关，因突变HBsAg可显著影响HBsAb的结合[24]。有研究表明HBV感染者接受肝移植后出现S基因突变病毒可导致移植失败[27]，在母婴传播阻断失败的婴儿体内也检测到了并非来自母亲的携有S基因突变的病毒株[28]。最近我国浙江大学学者在1例乙肝疫苗阻断母婴传播失败的3岁OBI患者样本中检出了一种sP120Q＋sD144A新型联合免疫逃逸突变毒株[29]。Yu等[24]发现携有S基因新增N-糖基化突变的病毒株也可以感染乙肝疫苗接种者。因此，S基因发生突变可赋予HBV逃逸抗体结合的特性，引起乙肝疫苗预防失效、高效价免疫球蛋白失去保护效用，因而S基因突变HBV具有在乙肝疫苗接种人群中传播及其引起特异性高效价免疫球蛋白阻断HBV感染失效的潜在风险。

3.4对临床免疫检测的影响 对HBsAg的检测主要依靠以抗原-抗体反应为基础的免疫方法，HBV前S/S基因突变引起HBsAg识别表位构象发生改变通常会引起不一样的检测结果。试剂不同，用同一种方法对同一标本进行检测，其结果也可能会不完全一致。有研究报道用同一种检测方法、7种不同的试剂盒对13种突变株分别进行检测，其结果并不是完全一致，表明前S/S区基因突变也会影响检测试剂的灵敏度和特异性[30]。HBV前S/S基因发生突变会影响HBsAg突变株的检测灵敏度下降，甚至还可能完全检测不到，造成临床上的漏诊、误诊。

4　应对HBV前S/S基因突变的相关措施

HBV前S/S基因的高突变率、低检出率、极易发生免疫逃逸、导致免疫预防失败、影响肝脏疾病进程等一系列问题，均给临床对HBV感染的预防、诊断、治疗和预后带来了挑战。前S/S基因变异有可能导致突变病毒在乙肝疫苗接种人群中传播的公共危害，须要引起我们的关注。

在检测技术上，使用灵敏度高、检测抗原性广的HBsAg检测试剂。对现有试剂识别差的新型突变，应考虑改进试剂，筛选加入可以识别突变抗原的抗体。在筛选献血员时，应同时检测HBV DNA。在研究中，采用巢式PCR技术对核酸序列的检测不失为一个高灵敏度、高特异性、高精确的检测方法，对HBV DNA载量低于检测下限的部分样本也能扩增出HBV目标基因序列。在疫苗技术上，利用基因重组技术合成带有前S区基因的疫苗，同时也应对现有疫苗诱导的抗体是否可以有效保护突变病毒的感染做出评估。在致病机制上，进一步深入研究前S/S基因与疾病进展的关系，包括扩大研究样本量，进行长期随访研究，阐明相关分子机制，获得前S/S基因突变株引起LC和HCC的直接实验证据。

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（2015-10-29 收稿 2015-12-01 修回）

（责任编委 王永怡 本文编辑 卢福昱）

Research progress of HBV preS/S gene mutations

LU Shan-shan, XU Dong-ping, LI Jin*
Graduate School of Guilin Medical College, Guilin, Guangxi Zhuang Autonomous Region 541004, China
*Corresponding author, E-mail: lijin302@hotmail.com

[Abstract]HBV preS/S gene mutations may occur spontaneously or may be the consequence of selection by outside pressures. The viral mutants may induce HBV infection through blood transfusion, organ transplantation and mother-to-children transmission, or cause acute, chronic and occult HBV infection. The HBV preS/S gene mutations may lead to the change of biological characteristics of the virus and the immune responses, causing immune escape, immunoprophylaxis failure, HBsAg-negative HBV infection and the aggravation of the disease. It suggests that the mutations are associated with the development of liver fibrosis and hepatocellular carcinoma, therefore affecting clinical outcome of chronic HBV infection.

[Key words]hepatitis B virus; gene type; mutation; disease progression

[通讯作者]李进，E-mail: lijin302@hotmail.com

[基金项目]国家自然科学基金项目（81373136、81271847）

DOI:10.3969/j.issn.1007-8134.2016.02.013

[文献标志码][中国图书资料分类号] R373.21；R-058；R394.112 A

[文章编号]1007-8134(2016)02-0112-05