荧光定量PCR仪检测疟原虫的研究分析

吕少茵 江西省上饶市广丰区卫生监督所 （江西 上饶 334600）

荧光定量PCR仪检测疟原虫的研究分析

吕少茵 江西省上饶市广丰区卫生监督所 （江西 上饶 334600）

目的：探讨荧光定量PCR仪检测疟原虫的应用价值。方法：选取我省出入境单位收集到的已经镜检法证实为恶性疟疾的全血样本32例、镜检为阴性的全血样本13例作为研究对象，所有样本中均提取DNA并加入RT-PCR检测试剂进行荧光定量PCR仪检测，观察分析检测结果。结果：荧光定量PCR仪检测结果显示：恶性疟疾全血样本23例、间日疟疾全血样本11例，阴性全血样本11例，诊断符合率95.6%。复检结果显示：2例标本通过PCR扩增、序列对照，发现其测序结果与公布的疟原虫序列一致，确定均含有疟原虫。结论：荧光定量PCR仪检测疟原虫的应用价值高，能够敏感、可靠的检出疟原虫DNA。

荧光定量PCR仪 疟原虫 疟疾诊断

疟疾是由疟原虫所致的虫媒传染病，属于全球性流行传染病，尤其是在非洲、中南美洲、东南亚的一些国家，恶性疟死亡率极高，因此加强疟疾诊断至关重要。当前镜检仍然是疟疾诊断的主要方法，但是由于国外疟区人群普遍服用抗疟药物在一定程度改变了原虫的正常形态，因此对镜检要求也逐渐提高，耗费的人力物力也明显增长[1,2]。近年来，疟原虫检测手段更加多样，本研究中主要探讨实时荧光定量PCR仪检测疟原虫的应用价值，现将结果报道如下：

1.材料与方法

1.1 一般资料

选取我省出入境单位2014年1月～2015年10月收集到的已经镜检法证实为恶性疟疾的全血样本32例（其中恶性疟疾全血样本23例，间日疟疾全血样本9例）、镜检为阴性的全血样本13例作为研究对象，将标本放置于抗凝管中，在4°C冰箱保存。

仪器和试剂：①仪器：荧光定量PCR仪（北京线上生物科技有限公司生产，美国ABI-2720 PCR仪），测量范围：4°C-99°C适用范围：2.7°C/s |品牌：ABI |温度范围：4°C-99°C，由荧光定量系统和计算机组成。②试剂：核酸释放剂（湖南圣湘生物科技有限公司研发），可提取样本中的疟原虫DNA，采用荧光定量PCR仪器进行疟原虫核酸检测。采用该试剂进行疟原虫DNA内标设置，于内标TaqMan探针处末端进行HEX荧光素标记，检测内标是否正常、标本中是否有PCR抑制物，有助于提高检测精确性，避免假阴性；设置防污染措施UNG+dutp，排除假阳性。

1.2 方法

制备疟原虫DNA模板：将全血样本进行离心处理，首先取200μL血液置于1.5mL离心管中，在其中添加中800μL红细胞裂解液，手动剧烈振荡管体15s至出现颜色清亮，4°C下离心1min（转速12000rpm/min）后可见白色沉淀；添加800μL核酸释放剂添加在沉淀中混合摇匀，离心后去上清，每1mLTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1mL的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），去除沉淀，混匀后在4°C下7000rpm离心5min，小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5～10min，将最终的沉淀物进行分离得到的核酸，取5μL作为待测样本。

引物、探针的设计：引物、探针的设计需参照恶性疟原虫、间日疟原虫的18sRNA基因共有保守序列，并采用Clustal version2.1进行多序列比对，最终确定引物、探针序列：P.falciparum:FAL-5︱-GCTTTTGAGAG GTTTTGTTACTTTGAGT；FAL-5︱-TGTTATTCCATGCT GTAGTATTCAAACAC；FAL paobe(FAM)-5︱-TGTT CATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCA。P.vivax: VIV-F5︱-ACGCTTCTAGCTTAATCCACATAACT；VIV-F5︱-CTCAAACTAACAAGGACTTCCAAGC；VIV paobe (TET)-5︱-TTCGTATCGACTTTGTGCGCATTTTGC。特异性比对后进行生物合成。

表1. 不符样本的复核情况

PCR扩增：在荧光定量PCR仪放置荧光反应管，将参数设置为：94°C/5min，94°C/15s，57°C/91s，共45个循环；25°C/30s；单点检测在57°C；反应体系设置为50μL，上机后进行扩增。

1.3 结果判定

阴性：标本FAM通道Ct栏显示UNDET或者40，表明＜400copis/mL（最低检测限）；阳性：标本FAM通道Ct栏显示≤38.如果样本FAM通道Ct栏数值显示38～40，需重复检测，如果两次结果相同，则为阴性。

2.结果

2.1 荧光RT-PCR检测与镜检法的一致性

本研究中共有全血样本45例，其中恶性疟疾全血样本23例，间日疟疾全血样本9例，阴性全血样本13例。荧光定量PCR仪检测结果显示：恶性疟疾全血样本23例、间日疟疾全血样本11例，阴性全血样本11例。诊断符合率95.6%。

2.2 不符样本的复核情况

研究中有2例标本初次荧光定量PCR仪检测结果均为阳性，但是镜检为阴性，因此对2例标本进行复检，通过PCR扩增、引物及探针序列对照，发现其测序结果与公布的疟原虫序列一致没确定均含有疟原虫。见表1。

3.讨论

疟疾是危害人类健康的重要传染病，据资料显示流行于102个国家和地区，每年发病人数约有2.5亿，死亡患者约有10万人，因此探索科学有效的方法进行疾病诊断具有重要的临床价值，有助于分析疟原虫感染疾病发展进程以及进行临床疗效评估。

传统的镜检法在疟原虫DNA载体量较低的情况下难以检出，且难以反映疟原虫的真实水平。采用荧光定量PCR仪进行检测是新型的疟疾诊断方法，主要是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实现对整个PCR进程实时监测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，简化了定量检测的过程，真正实现了绝对定量，工作效率高。当前国内生产的PCR试剂较为多样，但是这些试剂对不同类型的样本、疟原虫DNA病毒各型检测阳性率存在差异，最根本的原因在于核酸提取及其纯化方法存在漏洞[3]。本研究结果显示：荧光定量PCR仪检测与镜检法结果的诊断符合率为95.6%，且通过PCR扩增、序列对照发现其测序结果与公布的疟原虫序列一致，确定血液标本中均含有疟原虫，可见荧光定量PCR仪检测方法对全血样本的检测更为全面细致，能够有效减少假阴性结果的发生机率。另外本研究还存在一定的不足，例如全血样本数量搜集过少，未能严格评价荧光PCR试剂的线性范围，未来研究中仍需进一步探讨。

综上所述，荧光定量PCR仪检测疟原虫的应用价值高能够敏感、可靠的检出疟原虫DNA。

[1] 鲁少平, 邓中平, 龙妍娇, 等. 运用实时荧光RT-PCR方法检测疟原虫的研究[J]. 实用预防医学, 2015,22(10):1171-1173,1170.

[2] 陈玉凤, 王艳艳, 姜杰, 等. 应用巢式PCR评价低流行区疟疾诊断结果[J]. 国际医学寄生虫病杂志, 2013,40(6):311-316.

[3] 王艳艳. 影响约氏疟原虫在按蚊体内发育的因素及机制的初步研究[D]. 重庆:第三军医大学, 2011.

1006-6586(2016)09-0034-02

R382.3+1

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