粒细胞集落刺激因子保护急性损伤人胎肝细胞的实验研究

孙子健，陈 婧，夏衍珩，刘晓燕，苏海滨，杨昊臻，许 祥，胡瑾华



粒细胞集落刺激因子保护急性损伤人胎肝细胞的实验研究

孙子健，陈 婧，夏衍珩，刘晓燕，苏海滨，杨昊臻，许 祥，胡瑾华

[摘要]目的 建立D-半乳糖胺（D-galactosamine，D-GalN）对人胎肝细胞急性损伤的模型，观察粒细胞集落刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF）对人胎肝细胞损伤的保护作用。方法 分别用梯度浓度的D-GalN和不同的作用时间孵育人胎肝细胞，用四唑盐比色法（MTT法）检测细胞活性，以确定最佳的人胎肝细胞急性损伤造模条件。将胎肝细胞分为4组进行不同处理：第1组为空白对照组，第2组（G组）用G-CSF处理正常细胞，第3组（ND组）和第4组（GD组）都用D-GalN进行损伤造模，但GD组加入G-CSF作为治疗，第3组加入等量的0.9％氯化钠溶液作为实验对照。最后用MTT法和乳酸脱氢酶（LDH）释放量检测各组细胞活性。结果 当D-GalN浓度为10 mg/ml，作用时间为12 h时，可以杀伤90％以上的人胎肝细胞，并且可以保证有足够的药物反应时间。空白对照组和G组的细胞活性差异无统计学差异，但GD组细胞活性明显高于ND组（P＜0.05）。结论 D-GalN对人胎肝细胞急性损伤的造模条件为D-GalN 10 mg/ml作用12 h。G-CSF对D-GalN造成的人胎肝细胞急性损伤具有保护作用。

[关键词]肝功能衰竭; 人胎肝细胞; 粒细胞集落刺激因子

[作者单位] 100039 ，北京大学解放军第三〇二医院教学医院肝衰竭诊疗与研究中心（孙子健、夏衍珩、许祥、胡瑾华）；100039 北京，解放军第三〇二医院肝衰竭诊疗与研究中心（陈 婧、刘晓燕、苏海滨、杨昊臻、胡瑾华）

急性肝衰竭病因复杂，患者肝功能丧失迅速，病情危急，病死率极高，但缺乏有效治疗手段[1]。近年来应用粒细胞集落刺激因子（granulocytecolony stimulating factor, G-CSF）治疗肝衰竭已在肝衰竭动物模型中得到验证，临床试验也取得了一定效果[2-4]。传统观点认为G-CSF主要通过促进骨髓干细胞及肝干细胞（肝卵圆细胞）在肝脏内的增殖以修复肝脏[5-6]，这一过程体现在肝功能或肝组织的恢复需要一定的时间。然而不论是临床观察还是动物实验中，我们发现经过G-CSF治疗的患者或模型小鼠在治疗早期均有显著的肝功能改善，推测G-CSF可能通过某种机制直接保护肝脏细胞。本研究设计体外实验，用D-半乳糖胺（D-galactosamine, D-GalN）对人胎肝细胞造成急性损伤，观察G-CSF是否对人胎肝细胞急性损伤具有保护治疗作用。

1　材料与方法

1.1材料 人胎肝细胞由上海东方肝胆外科医院赠予，在配有5％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的杜尔伯科改良伊格尔培养基（dulbecco modified eagle medium，DMEM）中贴壁生长，置于37 ℃含95％空气加5％二氧化碳混合气体的细胞培养箱中培养。

1.2人胎肝细胞急性损伤造模 胎肝细胞以2×105/孔的密度在12孔板中贴壁稳定生长后，用不含血清的DMEM培养细胞12 h进行饥饿处理。D-GalN用DMEM溶解至浓度为8、9、10和11 mg/ml，以0.4 ml的体积加入各孔，测试12 h内不同浓度药物对胎肝细胞的杀伤力，再选出适宜浓度同法分别孵育细胞0、4、6、8、10、12和14 h 以确定合适的作用时间，2种试验均以四唑盐比色法（MTT法）对细胞活性进行检测。MTT用DMEM溶解后定容至0.5 mg/ml，每孔加入0.2 ml孵育细胞4 h，吸除MTT液，再每孔加入0.2 ml二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide, DMSO）充分溶解细胞后，从每孔中吸取0.1 ml加入96孔板，用分光光度仪测A490 nm时的吸光度。

1.3G-CSF对胎肝细胞的保护作用 如前所述将胎肝细胞铺至12孔板，随机分为4组：①空白对照组；② G-CSF组（G组）：G-CSF处理正常人胎肝细胞；③实验对照组（ND组）：0.9％氯化钠溶液处理人胎肝细胞急性损伤模型；④治疗组（GD组）：G-CSF处理人胎肝细胞急性损伤模型。对4组分别做如下处理：首先进行饥饿处理，将G-CSF（北京双鹭药业）用不含血清DMEM配置成10 μg/ml浓度，以0.4 ml体积加入G组和GD组，同时将相同体积的无血清DMEM加入空白对照组和ND组，共同孵育12 h。随后空白对照组和G组不进行处理，而对ND组及GD组进行造模处理（D-GalN浓度由前述实验获得），ND组加入0.4 ml溶有浓度为10 mg/ml D-GalN的无血清DMEM（其中混有与GD组内G-CSF等体积的0.9％氯化钠溶液），GD组则加入0.4 ml溶有 D-GalN 和G-CSF的无血清DMEM，其浓度分别为10 mg/ml 和10 μg/ml。以上4组再共同培养12 h，对细胞活性进行检测，除了继续应用上述的MTT法外，同时抽取细胞培养液进行乳酸脱氢酶（LDH）的浓度测定。

1.4统计学处理 用SPSS19.0软件进行统计分析。计量资料呈正态分布或近似正态分布，用±s表示。2组间计量资料比较用成组t检验（组间方差齐）。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1最佳的人胎肝细胞急性损伤造模条件的确定 分别用梯度浓度的D-GalN孵育人胎肝细胞12 h，可见当浓度达到10 mg/ml以上时，可杀伤90％以上的胎肝细胞（表1）。为确定适宜的D-GalN作用时间，我们又以10 mg/ml的浓度孵育胎肝细胞，观察到作用时间为4 h 时，可杀伤约50％的细胞，随着作用时间的延长，杀伤程度加重，当D-GalN孵育12 h，细胞损伤90％以上（表2）。因此综合以上情况选择的造模条件为D-GalN浓度10 mg/ml，作用时间12 h，这样既可以剧烈杀伤胎肝细胞（＞90％），又能保证进一步检测G-CSF保护作用有足够的反应窗口期。

表1　MTT法检测梯度浓度D-GalN对人胎肝细胞的杀伤作用（±s）Table 1 Injury effect of D-GalN at gradient concentrations on human fetal hepatocytes detected by MTT method (±s)

表1　MTT法检测梯度浓度D-GalN对人胎肝细胞的杀伤作用（±s）Table 1 Injury effect of D-GalN at gradient concentrations on human fetal hepatocytes detected by MTT method (±s)

D-GalN 浓度（mg/ml）　0　8　9　10　11 MTT吸光度（标准化OD值）　1.000±0.019　0.299±0.012　0.172±0.037　0.087±0.031　0.073±0.032

表2　MTT法检测在浓度为10 mg/ml 的D-GalN不同时间对人胎肝细胞的杀伤作用（±s）Table 2 Injury effect of D-GalN at the concentration of 10 mg/ml on human fetal hepatocytes detected by MTT method at different time points (±s)

表2　MTT法检测在浓度为10 mg/ml 的D-GalN不同时间对人胎肝细胞的杀伤作用（±s）Table 2 Injury effect of D-GalN at the concentration of 10 mg/ml on human fetal hepatocytes detected by MTT method at different time points (±s)

作用时间（h）　0　4　6　8　10　12　14 MTT吸光度（标准化OD值） 1.000±0.157 0.515±0.032 0.323±0.101 0.274±0.007 0.130±0.027 0.095±0.005 0.015±0.002

2.2G-CSF对D-GalN造成人胎肝细胞急性损伤保护作用测定 用浓度为10 mg/ml 的D-GalN作用12 h后检测人胎肝细胞活性，结果如下。

2.2.1MTT法检测结果 MTT法检测的是活细胞与试剂的反应能力，以吸光度值表示，值愈大代表细胞存活数量愈多，检测结果见表3。空白对照组与G组吸光度差异无统计学意义（t=1.425, P=0.227）；ND组吸光度明显低于空白对照组（t=42.581, P=0.000）；GD组吸光度明显高于ND组（t=3.029，P=0.013）。

2.2.2LDH法检测结果 LDH是在细胞死亡破裂时释放出来，因此LDH的值越高表示细胞死亡量越大。检测结果见表4。空白对照组与G组LDH浓度差异无统计学意义（t=0.316，P=0.768），ND组LDH浓度明显高于空白对照组（t=10.301，P=0.000），GD组LDH浓度明显低于ND组（t=6.779，P=0.000）。

表3　MTT法检测4组人胎肝细胞吸光度（ 标准化OD值,±s）Table 3 Absorbance of human fetal hepatocytes of the 4 groups detected by MTT method (standard OD,±s)

表3　MTT法检测4组人胎肝细胞吸光度（ 标准化OD值,±s）Table 3 Absorbance of human fetal hepatocytes of the 4 groups detected by MTT method (standard OD,±s)

组别　n　吸光度空白对照组　6　1.000±0.008 G组　6　0.956±0.011 ND组　6　0.164±0.032 GD组　6　0.221±0.033

表4　LDH法检测4组人胎肝细胞LDH浓度（U/L,±s）Table 4 Concentrations of LDH in fetal hepatocytes of the 4 groups detected by LDH method(U/L,±s)

表4　LDH法检测4组人胎肝细胞LDH浓度（U/L,±s）Table 4 Concentrations of LDH in fetal hepatocytes of the 4 groups detected by LDH method(U/L,±s)

组别　n　LDH浓度空白对照组　6　1.0±0.0 G组　6　1.0±0.0 ND组　6　20.7±4.7 GD组　6　4.0±3.8

空白对照组与G组人胎肝细胞存活数量差异无统计学意义，提示G-CSF对人胎肝细胞无损伤作用；ND组明显低于空白对照组，提示造模成功；GD组明显高于ND组，提示提示G-CSF对D-GalN所致的人胎肝细胞损伤具有直接保护作用。

3　讨论

D-GalN有特异的肝毒性，能够耗尽肝细胞内的三磷酸尿苷，从而阻断小分子化合物的合成，继而引起肝细胞的凋亡。它的这一特性已广泛应用于肝损伤的动物实验模型[7]，我们也选择D-GalN进行造模。人类原代肝细胞被认为是体外研究肝病最理想的实验对象，但获取效率极低且实验难度高，而人胎肝细胞因其仍可增殖而易于培养，并且已具备一系列肝细胞基因的表达，已较多地应用于肝脏疾病的体外研究[8]。我们首次成功在体外应用D-GalN对人胎肝细胞制作急性损伤模型，10 mg/ml D-GalN作用于人胎肝细胞12 h后即可造成90％以上的细胞损伤，同时也保证进一步验证G-CSF保护作用所需的反应窗口期。这一模型的构建，为探究G-CSF对胎肝细胞的直接作用提供了便利。MTT法可用于检测细胞活性和药物毒性，而利用死亡细胞释放LDH的量来评定细胞存活程度是更为精准的方法[9]。在判定G-CSF对胎肝细胞保护作用时，我们同时应用了这2种检测方法，以提高实验结果的准确性。我们的实验发现ND组与GD组相比，无论从MTT法还是LDH法的测定结果来看，GD组的细胞都显示了更高的细胞活性，证实G-CSF在体外可以直接保护人胎肝细胞减轻D-GalN的毒害作用，并且此保护作用相当显著。

关于G-CSF保护人胎肝细胞的机制，我们考虑一是由于G-CSF可能会帮助胎肝细胞增殖来维持较高的细胞活性，二是G-CSF可能直接保护胎肝细胞抵御凋亡坏死。对于第一种可能，从表3 和4的空白对照组和G组结果来看，G-CSF对胎肝细胞并无增殖作用。而对第二种可能，已有研究者在许多脑缺血和心肌梗死的实验中发现G-CSF能通过抵抗凋亡来保护神经元和心肌细胞[10-11]。因此我们设想G-CSF对于人胎肝细胞的保护也可能是通过抗凋亡作用实现的，对于其具体的分子机制，以及是否适用于原代肝细胞和体内实验，还需后续的实验验证。

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（2015-12-30 收稿 2016-02-20 修回）

（责任编委 王永怡 本文编辑 张云辉）

Protective effect of granulocyte-colony stimulating factor on acute injury of human fetal hepatocytes

SUN Zi-jian, CHEN Jing, XIA Yan-heng, LIU Xiao-yan, SU Hai-bin, YANG Hao-zhen, XU Xiang, HU Jin-hua*
Liver Failure Treatment and Research Center, 302 Military Hospital of China-Peking University Teaching Hospital, Beijing 100039, China
*Corresponding author, E-mail: hjh@medmail.com.cn

[Abstract]Objective To establish the model of acute injury of human fetal hepatocytes induced by D-galactosamine (D-GalN) and observe the protective effect of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) on the injury of fetal hepatocytes. Methods The human fetal hepatocytes were hatched by gradient concentrations of D-GalN at different action time, and their activities were detected by MTT assay, in order to determine the optimal conditions for establishing the model of acute injury of human fetal hepatocytes. The human fetal hepatocytes were divided into 4 groups, which received different treatments: the first group (control group) was the blank control group; normal fetal hepatocytes of the second group (group G) were treated with G-CSF; the injury was induced by D-GalN in both the third group (group ND) and the fourth group (group GD), but the human fetal hepatocytes of group GD were treated with G-CSF, and those of group ND with the same amount of normal saline instead of G-CSF. The activities of the hepatocytes of each group were detected by both MTT assay and LDH release assay. Results More than 90％ of human fetal hepatocytes could be killed by D-GalN at the concentration of 10 mg/ml for 12 hours. The medicine had enough time to play its protective effect. The activities of the hepatocytes were not significantly different between the control group and group G, while that of group GD was significantly higher than that of group ND (P<0.05). Conclusions The model of acute injury of human fetal hepatocytes can be established by D-GalN at the concentration of 10 mg/ml for 12 hours. G-CSF has a protective effect on the acute injury of human fetal hepatocytes induced by D-GalN.

[Key words]liver failure; human fetal hepatocytes; granulocyte-colony stimulating factor

[通讯作者]胡瑾华，E-mail: hjh@medmail.com.cn

[基金项目]国家自然基金面上项目（81171641）；北京市科技计划 首都特色临床应用研究项目（Z131107002213157）

DOI:10.3969/j.issn.1007-8134.2016.02.007

[文献标志码][中国图书资料分类号] R512.62 A

[文章编号]1007-8134(2016)02-0089-03