丙型肝炎直接抗病毒药物耐药相关变异的研究

陈建宏，徐小元



丙型肝炎直接抗病毒药物耐药相关变异的研究

陈建宏，徐小元

[摘要]直接抗病毒药物（direct-acting antiviral agents, DAAs）的应用使慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C, CHC）抗病毒治疗进入了新的时代，全口服的DAAs联合治疗方案抗病毒活性强、安全性好且不良反应少。耐药相关变异（resistanceassociated variants, RAV）的出现削弱了DAAs的抗病毒活性，给DAAs的临床应用带来了巨大的挑战。本文将对临床试验和体外研究中检测到的DAAs RAV及其在CHC患者中的自然发生率进行系统的阐述，以期为DAAs治疗效果的预测和治疗方案的选择提供有用的信息。

[关键词]丙型肝炎；直接抗病毒药物；耐药相关变异

[作者单位] 100034，北京大学第一医院感染疾病科（陈建宏、徐小元）

HCV感染是一个世界性的公共卫生问题，是导致慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C, CHC）、肝硬化和肝癌发生的主要原因。全球约有1.7亿人感染HCV，基因1型广泛分布于世界各地，2型和3型主要见于南美洲和亚洲，4～6型较少见[1]。目前我国HCV感染人数约为1000万，以 1b型（66％）和 2a型（14％）最为常见[2]。以往聚乙二醇干扰素α和利巴韦林联合应用是被广泛采用的CHC抗病毒治疗的标准方案，但未能取得令人满意的疗效，且相当一部分患者因禁忌证无法应用或因明显的不良反应被迫停药[3]。直接抗病毒药物（direct-acting antiviral agents, DAAs）的临床应用使CHC的治疗进入了新的时代，显著提高了治疗效果，减少了治疗的禁忌证和不良反应，给难治性CHC患者、存在干扰素和利巴韦林治疗禁忌证或不能耐受的CHC患者等特殊人群带来了新的希望[4]。根据DAAs的作用部位可以将其分为以下几类：非结构蛋白（non-structural, NS）3/4A 蛋白酶抑制剂、NS5A抑制剂、NS5B聚合酶抑制剂等[5]。

HCV复制力强，RNA聚合酶保真度低，导致HCV RNA的变异率很高，因此未经DAAs治疗患者的病毒准种中也可能存在耐药相关变异（resistance-associated variants, RAV）[6]。DAAs RAV的存在可以损害病毒株的适应性，导致复制力降低，所以大部分RAV是以较低的频率存在于病毒准种中，直接测序很少能检测到。在DAAs的作用压力下，这些低频的耐药株可以转化为优势株，削弱DAAs的抗病毒活性，甚至导致治疗失败[7]。本文对在临床试验和体外研究中发现的基因1型HCV的DAAs RAV及其在国内外不同CHC人群中的自然发生率进行系统的阐述，以期为DAAs在中国上市后治疗效果的预测和治疗方案的选择提供有用的信息。

1　临床试验和体外研究中发现的DAAsRAV

由于DAAs作用的部位、机制和浓度不同，HCV基因型或亚型和产生耐药的基因屏障不同，以及携带不同RAV的病毒株的适应性不同，针对不同HCV基因型或亚型和不同DAAs而产生的RAV也各不相同。

1.1NS3/4A蛋白酶抑制剂RAV NS3/4A蛋白酶抑制剂主要作用于NS3/4A蛋白酶的活性区域，抑制其对病毒多聚蛋白NS3-NS5的裂解，从而抑制病毒的复制和包装[8]。第一代蛋白酶抑制剂boceprevir（BOC）和telaprevir（TVR）抗病毒活性较弱，基因耐药屏障低，且须与干扰素和利巴韦林联合应用，不良反应重，有较多的药物相互作用，现已不被推荐使用，RAV主要涉及氨基酸位点V36、T54、V55、R155和A156（表1），其中V36A/M、T54A/S、V55A、R155K/G/T和A156S/ T/V在临床试验和体外研究中较常见[8-13]。第二代蛋白酶抑制剂simeprevir（SMV）、asunaprevir （ASV）和paritaprevir （PTV）在抗病毒活性和基因耐药屏障方面都有了提高，RAV主要涉及氨基酸位点Q80、R155和D168（表1），其中Q80K/ R、R155K和D168A/E/V/Y在临床试验和体外研究中较常见[12-16]。长期的随访研究显示NS3/4A蛋白酶抑制剂RAV在准种中的持续时间较短，停药后很快转换为野生型，且转换速度因HCV基因型和DAAs RAV的不同而不同。V36M、T54A、A156S、I/V170A和V36M转换速度较快，约为0.9年，而T54S、Q80K、R155K和 V55A转换较慢，约为1.1年，基因1b型发生转换的速度较1a型快[17]。

1.2NS5A抑制剂RAV 已上市的NS5A抑制剂主要有daclatasvir（DCV）、ledipasvir （LDV）和obmitasvir（OMV）。NS5A蛋白参与HCV生活周期的多个环节，NS5A抑制剂通过与NS5A蛋白结合从而抑制病毒的复制、包装和释放[8]，抗病毒效果强，但耐药屏障较低，RAV主要涉及氨基酸位点M/L28、Q/R30、L31、H/P58和Y93（表2），其中M/L28T、Q/R30E/H/R、L31M、H/P58D/S和Y93H/C/N在临床试验和体外研究中较常见[8，12-13，18-20]。NS5A抑制剂RAV在准种中持续的时间较NS3/4A蛋白酶抑制剂RAV长且适应性强，在治疗结束3年后仍可以检测得到[21]。

1.3NS5B聚合酶抑制剂RAV 已上市的NS5B聚合酶抑制剂主要有核苷类聚合酶抑制剂sofosbuvir（SOF）和非核苷类聚合酶抑制剂dasabuvir（DSV）。SOF是RNA聚合酶天然底物的类似物，可与 NS5B 聚合酶的天然底物竞争活性位点而被插入到新合成的RNA链中，终止RNA的合成[8]，从而抑制病毒的复制。可针对多种基因型，耐药屏障较高，抗病毒活性强且药物相互作用少。目前只是在体外研究中发现S282T和L320F对SOF有耐药作用，但并未从临床试验中检测到[22]。有研究从基因3型治疗失败的CHC患者体内检测到L159F和V321A，但体外研究未发现有耐药作用[23]。最近有研究从基因1型治疗失败的患者中检测到C316H/N/Y等变异位点，但是这些变异是否有耐药作用还须要进一步验证[24]。DSV能共价结合于NS5B聚合酶催化部位延伸区域的变构位点，干扰其变构激活[8]，使NS5B聚合酶失去催化活性从而抑制病毒的复制，抗病毒活性较强，但耐药屏障相对较低，RAV主要涉及氨基酸位点C316、M414、Y448和S556（表2），其中C316H/Y/N、M414I/ T、Y448H和S556G在临床试验和体外研究中较常见[12，25-27]。

表1　NS3/4A蛋白酶抑制剂RAVTable 1 Variants resistant to NS3/4A protease inhibitors

2　以往研究中报道的DAAsRAV的自然发生率

基线时DAAs RAV的存在会影响其治疗的效果，由于种族、地域及HCV基因型的不同，DAAs RAV的自然发生率也有很大的差异。这里我们对以往研究中直接测序法检测到的基因1型CHC患者中DAAs RAV的自然发生率[12-13, 25, 28-31]（表3）与我国1b型CHC患者中DAAs RAV的自然发生率[32]进行了总结，分析其在国内外CHC患者中的差异。

表2　NS5A抑制剂和NS5B聚合酶抑制剂RAVTable 2 Variants resistant to NS5A inhibitors and NS5B polymerase inhibitors

2.1NS3/4A蛋白酶抑制剂RAV的自然发生率 以往研究中基线时可以检测到的NS3/4A蛋白酶抑制剂RAV主要有V36M、T54A/S、V55A、Q80K/ R、R155K、D168E等（表3），大部分RAV的自然发生率较低（0％～2％），T54S在1b型CHC患者中较常见，V55A和Q80K/R在1a型CHC患者中较常见。我国1b型CHC患者中NS3/4A蛋白酶抑制剂RAV的自然发生率也大部分处于较低水平（＜1％），第一代NS3/4A蛋白酶抑制剂RAV T54S在我国1b型CHC患者中的发生率约为5.5％，但该位点对二代蛋白酶抑制剂在临床试验和体外研究中都无耐药作用[13, 32]；ASV RAV S122G在我国1b型CHC患者中的发生率约为56.6％，虽然该变异在体外研究中未见明显耐药作用[12, 32]，但由于体内外差异，临床应用ASV时应格外注意；对SMV有明显耐药作用的Q80K 在我国1b型CHC患者中发生率较低，该变异发生率因基因型和地域不同而变化较大，美洲人群发生率较高，欧洲人群发生率相对较低[8]；1a型CHC患者发生率高（4.8％～75.0％），1b型CHC患者发生率则较低（0.5％～1.2％）[13]。

2.2NS5A抑制剂RAV的自然发生率 以往研究中基线时可以检测到的NS5A抑制剂RAV主要有M28A/T/V、R30Q、L31M、L31I/F/V、P58S、A92T、Y93H等（表3）。M28A/T/V和A92T在1a型CHC患者中较常见，而R30Q、L31M、P58S 和Y93H在1b型CHC患者中较常见。我国1b型CHC患者中DCV RAV P58S的发生率约为2.0％，对NS5A抑制剂均有耐药作用的Y93H的发生率约为10.1％，但未检测到DCV RAV L31M的存在[32]。DCV/ASV联合治疗临床试验显示：基线时存在L31M和Y93H变异的患者对治疗不敏感，持续病毒应答（sustained virological response, SVR）率明显低于不存在耐药位点的患者（43％ vs 87％）[33]。并且有研究发现Y93H变异株的复制力增强，并与T83M的发生成明显的相关性，推测T83M可能作为补偿变异而增强了Y93H的适应性[34]。鉴于LY93H较强的耐药性和适应性，及在1b人群中较高的自然发生率，有研究建议DCV/ASV联合治疗前进行耐药检测，防止治疗的失败。

2.3NS5B聚合酶抑制剂RAV的自然发生率S282T仅在体外研究中对核苷类聚合酶抑制剂SOF有耐药作用，但是在临床试验和预存耐药的研究中均未发现该变异。以往研究中基线时可以检测到的非核苷类聚合酶抑制剂DSV RAV主要有C316H/N/Y、A553I/T/V、S556G等（表3）。A553I/ T/V在1a型CHC患者中较常见，C316H/N/Y和S556G在1b型CHC患者中较常见。我国1b型CHC患者中S556G发生率较低，而C316N在我国人群中发生率却高达94％[32]，但由于种族和地域性差异，该变异是否会对DSV的临床应用产生影响还有待研究。

表3　以往研究中报道的DAAs RAV的自然发生率（％）Table 3 Natural prevalence of variants resistant to DAAs reported in the previous studies(％)

3　小结

DAAs带动了CHC治疗方案的不断革新，最近在美国、欧洲和日本批准的全口服DAAs联合治疗方案可以将SVR率提高到90％以上，但RAV的出现给DAAs的临床应用带来了许多挑战[35]。基线DAAs RAV的存在可以显著影响基因耐药屏障相对较低的NS3/4A蛋白酶抑制剂和NS5A抑制剂的治疗效果。虽然直接测序显示大部分DAAs RAV的自然发生率较低，但是深度测序显示它们几乎存在于所有CHC患者的准种中，为了实现彻底消灭CHC的最终目标，基因耐药屏障更高和覆盖基因型更广的DAAs还有待被研发。DAAs在一些国家取得了较好的治疗效果，在中国DAAs还处于临床试验阶段。由于HCV基因型、种族和地域的差异，我国CHC患者中部分DAAs RAV的自然发生率相对较高，其是否会影响DAAs的治疗效果及治疗前是否应进行RAV的检测目前仍存在争议，还有待更多临床和实验室数据来衡量。

【参考文献】

[1] Bartenschlager R, Lohmann V, Penin F. The molecular and structural basis of advanced antiviral therapy for hepatitis C virus infection［J］. Nat Rev Microbiol, 2013, 11(7):482-496.

[2] 李杰，陈杰，庄辉. 丙型肝炎的流行病学［J］. 实用肝脏病杂志，2012，15(5):379-381.

[3] European Association for Study of Liver. EASL recommendations on treatment of hepatitis C 2015 ［J］. J Hepatol, 2015, 63(1):199-236.

[4] 饶慧英. 慢性丙型肝炎直接作用抗病毒药物的临床应用［J］.传染病信息，2015，28(5):266-269.

[5] 李敏然，徐小元. 抗 HCV小分子化合物的研究［J］. 临床肝胆病杂志，2014，30(6):493-495.

[6] Perales C, Quer J, Gregori J, et al. Resistance of hepatitis C virus to inhibitors: complexity and clinical implications［J］. Viruses, 2015, 7(11):5746-5766.

[7] Kumthip K, Maneekarn N. The role of HCV proteins on treatment outcomes［J］. Virol J, 2015, 12(1):217.

[8] Cento V, Chevaliez S, Perno CF. Resistance to direct-acting antiviral agents: clinical utility and significance［J］. Curr Opin HIV AIDS, 2015, 10(5):381-389.

[9] 张玉，徐小元. 直接抗丙肝病毒药物耐药及预存耐药的研究［J］. 中华医学杂志，2015，95(31):2569-2571.

[10] Howe JA, Long J, Black S, et al. Clinical implications of detectable baseline hepatitis C virus-genotype 1 NS3/4A-protease variants on the efficacy of boceprevir combined with peginterferon/ribavirin［J］. Open Forum Infect Dis, 2014, 1(2):ofu078.

[11] Jiang M, Mani N, Lin C, et al. In vitro phenotypic characterization of hepatitis C virus NS3 protease variants observed in clinical studies of telaprevir［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(12):6236-6245.

[12] Lontok E, Harrington P, Howe A, et al. Hepatitis C virus drug resistance-associated substitutions: state of the art summary［J］. Hepatology, 2015, 62(5):1623-1632.

[13] Sarrazin C. The importance of resistance to direct antiviral drugs in HCV infection in clinical practice［J］. J Hepatol, 2016, 64(2):486-504.

[14] Pilot-Matias T, Tripathi R, Cohen D, et al. In vitro and in vivo antiviral activity and resistance profile of the hepatitis C virus NS3/4A protease inhibitor ABT-450［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 59(2):988-997.

[15] McPhee F, Friborg J, Levine S, et al. Resistance analysis of the hepatitis C virus NS3 protease inhibitor asunaprevir［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2012, 56(7):3670-3681.

[16] Lenz O, Verbinnen T, Lin TI, et al. In vitro resistance profile of the hepatitis C virus NS3/4A protease inhibitor TMC435［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54(5):1878-1887.

[17] Howe AY, Long J, Nickle D, et al. Long-term follow-up of patients receiving boceprevir for treatment of chronic hepatitis C［J］. Antiviral Res, 2015, 113:71–78.

[18] Lawitz EJ, Gruener D, Hill JM, et al. A phase 1, randomized, placebo-controlled, 3-day, dose-ranging study of GS-5885, an NS5A inhibitor, in patients with genotype 1 hepatitis C［J］. J Hepatol, 2012, 57(1):24-31.

[19] Nelson DR, Cooper JN, Lalezari JP, et al. All-oral 12-week treatment with daclatasvir plus sofosbuvir in patients with hepatitis C virus genotype 3 infection: ALLY-3 phase III study［J］. Hepatology, 2015, 61(4):1127-1135.

[20] Krishnan P, Beyer J, Mistry N, et al. In vitro and in vivo antiviral activity and resistance profile of ombitasvir, an inhibitor of hepatitis C virus NS5A［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 59(2):979-987.

[21] Wang C, Sun JH, O’Boyle DR, et al. Persistence of resistant variants in hepatitis C virus-infected patients treated with the NS5A replication complex inhibitor daclatasvir［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(5):2054–2065.

[22] Tong X, Le Pogam S, Li L, et al. In vivo emergence of a novel mutant L159F/L320F in the NS5B polymerase confers low-level resistance to the HCV polymerase inhibitors mericitabine and sofosbuvir［J］. J Infect Dis, 2014, 209(5):668-675.

[23] Svarovskaia ES, Dvory-Sobol H, Parkin N, et al. Infrequent development of resistance in genotype 1-6 hepatitis C virusinfected subjects treated with sofosbuvir in phase 2 and 3 clinical trials［J］. Clin Infect Dis, 2014, 59(12):1666-1674.

[24] Donaldson EF, Harrington PR, O’Rear JJ, et al. Clinical evidence and bioinformatics characterization of potential hepatitis C virus resistance pathways for sofosbuvir［J］. Hepatology, 2015, 61(1):56-65.

[25] Poordad F, Hezode C, Trinh R, et al. ABT-450/rombitasvir and dasabuvir with ribavirin for hepatitis C with cirrhosis［J］. N Engl J Med, 2014, 370(21):1973-1982.

[26] Kati W, Koev G, Irvin M, et al. In vitro activity and resistance profile of dasabuvir, a nonnucleoside hepatitis C virus polymerase inhibitor［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 59(3):1505-1511.

[27] Poordad F, Hezode C, Trinh R, et al. ABT-450/rombitasvir and dasabuvir with ribavirin for hepatitis C with cirrhosis［J］. N Engl J Med, 2014, 370(21):1973-1982.

[28] Shindo H, Maekawa S, Komase K, et al. Characterization of naturally occurring protease inhibitor-resistance mutations in genotype 1b hepatitis C virus patients［J］. Hepatol Int, 2012, 6(2):482-490.

[29] Dietz J, Susser S, Berkowski C, et al. Consideration of viral resistance for optimization of direct antiviral therapy of hepatitis C virus genotype 1-infected patients［J］. PLoS One, 2015, 10(8):e0134395.

[30] Bartels DJ, Sullivan JC, Zhang EZ, et al. Hepatitis C virus variants with decreased sensitivity to direct-acting antivirals (DAAs) were rarely observed in DAA-naive patients prior to treatment［J］. J Virol, 2013, 87(3):1544-1553.

[31] Aissa Larousse J, Trimoulet P, Recordon Pinson P, et al. Prevalence of hepatitis C virus (HCV) variants resistant to NS5A inhibitors in na ve patients infected with HCV genotype 1 in Tunisia［J］. Virol J, 2015, 12:84.

[32] Wang Y, Rao HY, Xie XW, et al. Direct acting antiviral agents resistance -associated polymorphisms in Chinese treatment-naïve patients infected with genotype 1b hepatitis C virus［J］. Chin Med J, 2015, 128(19):2625-2631.

[33] Kumada H, Suzuki Y, Ikeda K, et al. Daclatasvir plus asunaprevir for chronic HCV genotype 1b infection［J］. Hepatology, 2014, 59(6):2083–2091.

[34] Peiffer KH, Sommer L, Susser S, et al. Interferon lambda 4 genotypes and resistance-associated variants in patients infected with hepatitis C virus genotypes 1 and 3［J］. Hepatology, 2016, 63(1):63-73.

[35] 张霞霞，徐小元. 小分子化合物抗丙型肝炎治疗新方案［J］.传染病信息，2015，28(4):197-199.

（2016-01-04 收稿 2016-02-18 修回）

（责任编委 李 军 本文编辑 卢福昱）

Research of HCV variants resistant to direct-acting antiviral agents

CHEN Jian-hong, XU Xiao-yuan*
Department of Infectious Diseases, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China
*Corresponding author, E-mail: xiaoyuanxu6@163.com

[Abstract]The development of direct-acting antiviral agents (DAAs) leads the antiviral therapy of chronic hepatitis C (CHC) into a new era, and all-oral DAA combination regimens have highly antiviral activity with improved drug safety and reduced side effects. The selection of resistance-associated variants attenuates the antiviral activity of DAAs and brings a great challenge to the clinical application of DAAs. This review provides a systematic elaboration of HCV variants resistant to DAAs observed in clinical trials and invitro studies and their natural prevalence in CHC patients, in the hope of providing useful information for predicting therapeutic efficacy and selecting DAA combination regimens.

[Key words]hepatitis C; direct-acting antivirals; resistance-associated variants

[通讯作者]徐小元，E-mail: xiaoyuanxu6@163.com

[基金项目]国家自然科学基金（81373056）；国家“十二五”科技重大专项（2012ZX10002003-004-003）

DOI:10.3969/j.issn.1007-8134.2016.02.014

[文献标志码][中国图书资料分类号] R512.63；R392.116 A

[文章编号]1007-8134(2016)02-0116-05