3种戊唑醇剂型对斑马鱼的急性毒性评价

王雅东 林庆胜 李祥英 夏晓明

摘要：【目的】評估不同戊唑醇剂型对斑马鱼的急性毒性差异，筛选出环保剂型，减少化学农药使用过程对水生态环境的污染。【方法】采用半静态法测定430 g/L戊唑醇悬浮剂、60 g/L戊唑醇悬浮种衣剂和25%戊唑醇水乳剂对斑马鱼的急性毒性，并根据有毒化学物质毒性等级分类标准进行毒性分级。【结果】430 g/L戊唑醇悬浮剂对斑马鱼24、48、72和96 h的半致死浓度（LC50）分别为7.89、7.87、7.84和7.81 a.i.mg/L，60 g/L戊唑醇悬浮种衣剂对斑马鱼24、48、72和96 h的LC50分别为6.20、5.68、5.32和5.28 a.i.mg/L，25%戊唑醇水乳剂对斑马鱼24、48、72和96 h的LC50分别为3.29、3.18、3.12和3.10 a.i.mg/L。依据OECD对有毒化学物质的毒性等级分类标准，可确定3种戊唑醇剂型对斑马鱼的急性毒性均为II级毒性，对斑马鱼的安全性排序为430 g/L戊唑醇悬浮剂>60 g/L戊唑醇悬浮种衣剂>25%戊唑醇水乳剂。【结论】不同戊唑醇剂型对斑马鱼的急性毒性不同，其中以悬浮剂型对斑马鱼的急性毒性最低，因此在农业生产中使用戊唑醇防控植物病害时应尽量采用悬浮剂，以减少对水生态系统的污染。

关键词： 斑马鱼；戊唑醇；剂型；急性毒性

中图分类号： S917.4 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）08-1406-05

Abstract：【Objective】In order to screen out tebuconazole formulations that safe and friendly for environment， and reduce pollution of chemical pesticides to water ecosystem environment， the differences in acute toxicity of tebuconazole formulations to zebrafish were assessed. 【Method】The acute toxicity of three tebuconazole formulations viz.， 430 g/L tebuconazole suspension concentrate（SC）， 60 g/L tebuconazole flowable concentrate for seed coating（FS） and 25% tebuconazole emulsion in water（EW） to adult zebrafish were determined by semi-static test. The toxicities of three tebuconazole formulations were classified according to toxicity grade classification standard of toxic chemicals. 【Result】The results showed that， the 24， 48， 72 and 96 h median lethal concentrations（LC50） of 430 g/L tebuconazole SC for zebrafish were 7.89， 7.87， 7.84 and 7.81 a.i.mg/L， respectively. The 24， 48， 72 and 96 h LC50 values of 60 g/L tebuconazole FS were 6.20， 5.68， 5.32 and 5.28 a.i.mg/L， respectively， and the 24， 48， 72 and 96 h LC50 of 25% tebuconazole EW were 3.29， 3.18， 3.12 and 3.10 a.i.mg/L， respectively. According to toxicity grade classification standard of toxic chemicals of OEDC， the toxicities of three formulations of tebuconazole to adult zebrafish were acute II， and the securities of different formulations of tebuconazole to adult zebrafish was different， their order was 430 g/L tebuconazole SC>60 g/L tebuconazole FS>25% tebuconazole EW. 【Conclusion】There are some differences in acute toxicity of different tebuconazole formulations to zebrafish. Therefore， tebuconazole SC should be first choose to control plant disease in agriculture production because of its the least acute-toxicity to zebrafish， so as to reduce pollution to water ecosystem.

Key words： zebrafish； tebuconazole； formulation； acute toxicity

0 引言

【研究意义】三唑类杀菌剂为有机杂环类化合物，具有高效、广谱、低残留、持效期长、内吸性强等特点，兼具保护、治疗、铲除和熏蒸作用，已广泛应用于农业生产中的植物病虫害防治。戊唑醇是20世纪80年代开发的一种三唑类内吸性杀菌剂，对白粉菌属、柄锈菌属、喙孢属、核腔菌属和壳针孢属引起的病害具有显著防治效果，目前主要用于防治小麦、花生、蔬菜、香蕉、苹果、梨等作物上的真菌病害（李富根等，2001；王新茹等，2008；华乃震，2013；孔祥英等，2014；李洪等，2014）。戊唑醇是农业生产中最常用的杀菌剂品种之一，也是我国使用量最大的杀菌剂，但大量使用也会给生态环境造成一定的影响和压力。因此，有必要进一步明确不同剂型戊唑醇的急性毒性，以减少不必要的污染和浪费，也为制定科学合理的用药方案提供参考依据。【前人研究进展】戊唑醇作为一种化学农药，对哺乳动物和非靶标生物均有一定的毒性作用。已有研究表明，戊唑醇对哺乳动物有一定的蓄积毒性作用，可引起小白鼠等物种的潜在慢性中毒（杨秀鸿等，2010）。对于非靶标昆虫而言，戊唑醇对家蚕的急性毒性等级为低毒性，在桑园周围农业环境使用存在中等风险（池艳艳等，2014），但对玉米螟和赤眼蜂具有高风险性（宋光林等，2014）。戊唑醇对水生生物的毒性因物种的不同而存在一定差异，如对小球藻的急性毒性为低毒（张金洋等，2013），对花翅摇蚊的急性毒性则为中毒（赵燕等，2012），对斑马鱼的急性毒性等级亦为中毒，尤其对斑马鱼胚胎具有明显的致死、致畸、抑制发育等不良影响（周炳等，2008；Oscar et al.，2011；李俊等，2013）。除急性毒性外，低剂量的戊唑醇还会影响斑马鱼的甲状腺激素水平及其基因转录水平（Yu et al.，2013），且通过卵黄蛋白原、三酸甘油酯、胆固醇、葡萄糖、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶等综合破坏斑马鱼的生理行为（Sancho et al.，2010）。【本研究切入点】相同成分化学农药不同剂型对生态环境的毒性受助溶剂、消解动态及环境行为等因素的影响。目前，生产中常用的戊唑醇主要有悬浮剂、悬浮种衣剂和水乳剂等剂型，但有关不同剂型对水生生物的毒性评估鲜见研究报道。【拟解决的关键问题】采用半静态法测试430 g/L戊唑醇悬浮剂、60 g/L戊唑醇悬浮种衣剂和25%戊唑醇水乳剂对斑马鱼的急性毒性，评估3种常用剂型对斑马鱼的毒性差异，以期筛选出环保剂型，减少化学农药使用过程对水生态环境的污染。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

430 g/L戊唑醇悬浮剂、60 g/L戊唑醇悬浮种衣剂和25%戊唑醇水乳剂均由山东农业大学环境毒理研究中心提供。斑马鱼（Brachydonio rerio）购自广州杨氏水族馆，体长2.00±0.10 cm，在实验室条件下驯养7 d以上，每天光照12～16 h，死亡率保持在5%以下，驯养期间每天喂食1～2次，测试前24 h停止喂食，试验期间不喂食。挑选体长均匀一致、健康活泼的斑马鱼用于急性毒性试验。

1. 2 试验方法

参考中华人民共和国环保部颁发的《化学农药环境安全评价试验准则》和OECD试验准则，采用半静态法测定各剂型对斑马鱼的急性毒性。根据预试验结果，每个剂型设置7个试验浓度（表1）。每处理设3次重复，每个重复10尾斑马鱼，每24 h更换药液1次。试验开始后6 h内观察并记录试验鱼的中毒情况及死亡数量，其后则在24、48、72、96 h观察记录斑马鱼的中毒症状及死亡数量。用玻璃板轻触斑马鱼尾部无反应运动即判断其死亡，并及时捞出已死亡的斑马鱼。每天测定并记录试验药液温度、pH及溶解氧。

1. 3 统计分析

试验数据用SPSS 16.0进行处理，计算供试药剂对斑马鱼24、48、72和96 h的半致死浓度（LC50）和95%置信限。致死量标准差S=log-1（1/b），其中，S为致死量标准差，b为毒理回归方程斜率（窦丰满等，2002）；并根据有毒化学物质毒性等级分类标准进行毒性分级（OECD，2001）。

在毒理回归方程中，b是计算LC50的中间量，而非定值，因而不能用于表示剂量死亡曲线的坡度和急性毒性作用，1/b也不能作为试验精密度指数。但S作为化学品毒性指标可用于度量剂量死亡曲线的坡度，急性毒性作用带及试验精密度指数实际上也是度量最小致死量的个体差异，因此可用S表示。S值大表示坡度小，反之表示坡度大。若处理间的LC50相近但S不同，其毒性仍有差别（窦丰满等，2002）。

2 结果与分析

2. 1 斑马鱼在3种戊唑醇剂型中的中毒症状

斑马鱼受到戊唑醇作用后均表现出兴奋症状，低浓度处理下其腮部淤血，腹部微红；高浓度处理时，随处理时间的延长，斑马鱼开始游动失衡，行动迟缓，腮部淤血，腹部微红，鱼鳍微张，最后死亡。死亡斑马鱼的鱼体发白，身体弯曲，如图1所示。

2. 2 戊唑醇悬浮剂对斑马鱼的急性毒性评价结果

430 g/L戊唑醇悬浮剂半静态测定结果显示，其对斑马鱼的LC50和S均较稳定，如表2所示。其中，24、48、72和96 h的LC50分别为7.89、7.87、7.84和7.81 a.i.mg/L，S分別为1.16、1.17、1.17和1.16。由于时间限制，430 g/L戊唑醇悬浮剂对斑马鱼的急性毒性随时间延长而增强的趋势不明显。依据OECD对有毒化学物质毒性等级分类标准，可确定430 g/L戊唑醇悬浮剂对斑马鱼的急性毒性为II级毒性。

2. 3 戊唑醇悬浮种衣剂对斑马鱼的急性毒性评价结果

60 g/L戊唑醇悬浮种衣剂对斑马鱼的急性毒性结果如表3所示，24、48、72和96 h的LC50分别为6.20、5.68、5.32和5.28 a.i.mg/L，各处理间的LC50无显著差异（P>0.05，下同），其对应的S分别为1.18、1.18、1.17和1.18。各处理间的LC50和S均相近，说明各处理间的毒性差异不明显。但LC50随时间的延长有降低趋势，说明该剂型对斑马鱼的急性毒性会随时间的延长而增强，但在96 h内毒性增加不显著。依据OECD对有毒化学物质毒性等级分类标准，可确定60 g/L戊唑醇悬浮种衣剂对斑马鱼的急性毒性为II级毒性。

2. 4 戊唑醇水乳剂对斑马鱼的急性毒性评价结果

25%戊唑醇水乳剂对斑马鱼的急性毒性发展趋势与430 g/L戊唑醇悬浮剂和60 g/L戊唑醇悬浮种衣剂一致，随时间的延长而呈增强趋势，但急性毒性较高。由表4可以看出，24、48、72和96 h的LC50分别为3.29、3.18、3.12和3.10 a.i.mg/L，对应的S为1.23、1.30、1.29和1.30。其中，处理24 h的S最小，即其毒性曲线坡度最大，引起死亡所需的浓度变化较小。依据OECD对有毒化学物质毒性等级分类标准，可确定25%戊唑醇水乳剂对斑马鱼的急性毒性为II级毒性。

虽然430 g/L戊唑醇悬浮剂、60 g/L戊唑醇悬浮种衣剂和25%戊唑醇水乳剂对斑马鱼的急性毒性均为II级毒性，但通过对其LC50进行比较分析，发现430 g/L戊唑醇悬浮剂的LC50最高，60 g/L戊唑醇悬浮种衣剂次之，25%戊唑醇水乳剂的最低，即这3种药剂对斑马鱼的安全性排序为430 g/L戊唑醇悬浮剂>60 g/L戊唑醇悬浮种衣剂>25%戊唑醇水乳剂。

3 讨论

在自然生态系统中，农药的性质、剂型、实际使用量、降解行为及环境条件状况等均会影响农药对农田生态环境的安全性（李祥英等，2014），但我国目前尚缺乏较完善的农药环境暴露风险评估模型。斑马鱼是农药环境风险评估中测试农药急性毒性试验的重要生物材料，也是表征农药对水环境中非靶标生物影响的模式生物（Andreu-Sánchez et al.，2011；Sipes et al.，2011）。农药对斑马鱼的急性毒性试验数据在一定程度上可为农药的风险管理和科学用药提供重要的参考依据，陈爱梅等（2013）、李俊等（2013）和李祥英等（2014）分别研究报道了戊唑醇原药对斑马鱼的急性毒性，虽然急性毒性结果有所差异，但均将戊唑醇对斑马鱼的急性毒性划分为中等毒性。

受填充材料、有效成分含量等因素的影响，相同化学农药不同剂型间对环境生物的急性毒性存在显著差异。如吡虫啉悬浮剂对蚯蚓的急性毒性等级为高毒，湿拌种剂、悬浮种衣剂和可湿性粉剂对蚯蚓的急性毒性等级则为中毒（陈爱梅等，2013）；毒死蜱微囊悬浮剂对鱼类、鸟类、家蚕和蜜蜂4种环境生物的安全性明显高于乳油制剂（季静等，2010）。因此，评价不同农药剂型对环境生物的安全性对研发低毒农药剂型、合理使用农药、减少农药对农业生态环境的污染、保护生态多样性均具有重要意义。依据OECD对有毒化学物质毒性等级分类标准，本研究将430 g/L戊唑醇悬浮剂、60 g/L戊唑醇悬浮种衣剂和25%戊唑醇水乳剂对斑马鱼的急性毒性等级均鉴定为II级毒性，等同于国内标准中的中等毒性，与李俊等（2013）、李祥英等（2014）研究戊唑醇原药对斑马鱼的急性等级相同。本研究结果表明，430 g/L戊唑醇悬浮剂对斑马鱼24、48、72和96 h的LC50分别为7.89、7.87、7.84和7.81 a.i.mg/L，60 g/L戊唑醇悬浮种衣剂对斑马鱼24、48、72和96 h的LC50分别为6.20、5.68、5.32和5.28 a.i.mg/L，25%戊唑醇水乳剂对斑马鱼24、48、72和96 h的LC50分别为3.29、3.18、3.12和3.10 a.i.mg/L，其中25%戊唑醇水乳剂对斑马鱼的急生毒性是430 g/L戊唑醇悬浮剂的2倍左右。一般来说，不同剂型间的毒性差异主要来源于有机溶剂作用或有机溶剂与原药的协同作用。农药悬浮剂在制作过程中避免使用任何溶剂，而水乳剂在加工过程中需加入一定量的溶剂，故悬浮剂较水乳剂相比更安全环保（华乃震和华纯，2013a，2013b）。因此，实际生产中应根据防控靶标和对象选择合理的戊唑醇剂型或产品，尽可能选择悬浮剂，并严格控制使用剂量和使用方式，以减少对水生态系统的污染。

4 结论

不同戊唑醇剂型对斑马鱼的急性毒性不同，其中以悬浮剂型对斑马鱼的急性毒性最低，在农业生产中使用戊唑醇防控植物病害时应尽量采用悬浮剂，以减少对水生态系统的污染。

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（責任编辑 兰宗宝）