抑郁症大鼠海马-杏仁核pMAP-2表达改变及人参皂苷Rb1的干预作用

刘继刚，袁杨，臧蔚，刘昊△

实验研究

抑郁症大鼠海马-杏仁核pMAP-2表达改变及人参皂苷Rb1的干预作用

刘继刚1，袁杨2，臧蔚2，刘昊2△

摘要：目的观察人参皂苷Rb1对抑郁大鼠海马-杏仁核组织磷酸化微管相关蛋白-2（pMAP-2）的影响。方法将30只健康SPF级成年雄性Wistar大鼠随机均分为对照组、模型组和治疗组。采用慢性不可预见性温和应激（CUMS）结合孤养建立抑郁症大鼠模型（模型组），治疗组在造模的同时灌胃给予人参皂苷Rb1（药液含原生药1 g/mL，剂量1 mL/100 g体质量，1次/d）；对照组除每天抓取1次外，不作其他处理，持续22 d。采用Western blot法检测海马、杏仁核组织微管相关蛋白-2（MAP-2）及pMAP-2蛋白表达，Real-time PCR检测pMAP-2 mRNA表达。结果模型组大鼠海马和杏仁核组织pMAP-2蛋白和mRNA表达水平以及pMAP-2/MAP-2比值均明显低于对照组（均P<0.05），治疗组pMAP-2蛋白和mRNA表达水平以及pMAP-2/MAP-2比值较模型组明显升高，但仍低于对照组（均P<0.05）。结论人参皂苷Rb1可能通过抑制MAP-2磷酸化水平来发挥抗抑郁作用。

关键词：人参皂苷；抑郁症；海马；杏仁核；微管相关蛋白；磷酸化微管相关蛋白-2

随着生活压力增大和应激事件的不断增多，抑郁症（depression）等精神性疾病的发病率呈现增高趋势［1］。反复的应激是导致抑郁症发生的根本原因，但抑郁症的具体发病机制尚未明确。研究发现，抑郁症患者海马、杏仁核等部位存在体积缩小的现象［2-3］，这可能与这些部位细胞骨架相关蛋白磷酸化有关［4］。人参是我国传统名贵药材，具有补气、安神、生津、益智等作用。研究表明，人参皂苷（Ginsenoside）活性成分Rb1具有明显的抗抑郁作用［5-6］，但其具体作用机制尚未明确。本研究通过建立应激性抑郁症大鼠模型，观察人参皂苷Rb1对大鼠海马、杏仁核磷酸化微管相关蛋白-2（pMAP-2）的影响，以探讨人参皂苷Rb1抗抑郁症的可能机制。

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81201048）

作者单位：1遵化市人民医院口腔科（邮编064200）；2华北理工大学附属医院神经内科

作者简介：刘继刚（1962），男，主治医师，主要从事应激性疾病发生机制研究

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通讯作者E-mail:liuhao938@163.com

1　材料与方法

1.1动物与试剂健康SPF级成年雄性Wistar大鼠30只，体质量180～210 g，实验动物合格证号：SCXK京2009-0004，由华北理工大学实验动物中心提供。适应性饲养1周后用于实验。兔微管相关蛋白-2（MAP-2）多克隆抗体和兔pMAP-2多克隆抗体购自Santz Cruz公司，Western blot相关试剂购自武汉博士德生物工程有限公司，Real-time PCR试剂盒购自TaKaRa公司。人参皂苷Rb1购自中国药品生物制品检定所。其他试剂为国产分析纯。

1.2实验分组和抑郁症模型的建立适应性饲养结束后，采用随机数字表法将大鼠分为对照组、模型组和治疗组，每组10只。采用慢性不可预见性温和应激（CUMS）结合孤养的方法建立抑郁症模型大鼠，应激包括夹尾1 min、黑白颠倒、天敌声音3 min、冰水强迫游泳15 min、热水强迫游泳15 min、潮湿垫料、鼠笼倾斜等11种。每天给予1种应激，造模共持续22 d，具体方法参见文献［3］。治疗组大鼠在造模同时通过灌胃给予人参皂苷Rb1，每日1次（药液含原生药1 g/ mL，剂量：1 mL/100 g体质量）。对照组除每天抓取1次外，不作其他处理。

1.3Western blot检测海马、杏仁核MAP-2和pMAP-2蛋白表达每组各取5只大鼠，麻醉后断头取脑，冰上快速分离海马和杏仁核，加适量RIPA裂解液完全裂解后，4℃12 000 r/min离心10 min，收集上清液。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，按照40 μg蛋白量上样，进行10%SDS-PAGE电泳，2 h 后PVDF膜电转印（180 mA，1.5 h），5%牛血清白蛋白室温封闭1 h，PBST漂洗后，加MAP-2一抗（1∶500），4℃孵育过夜，加辣根过氧化物酶标记的二抗IgG（1∶2 000）37℃孵育1 h，ECL显色。同上述方法进行pMAP-2和内参照β-actin的Westen blot分析。以目的条带与内参照的光密度比值表示蛋白表达。

1.4Real-time PCR检测pMAP-2 mRNA表达每组各取5只大鼠，麻醉后断头取脑，在冰上快速分离海马和杏仁核组织，提取总RNA。定量后取1 μg RNA，按照试剂盒说明书进行反转录和 PCR扩增。引物序列：正义 5′-TGGCTTTCTCATCTCCATCC-3′，反义5′-CTCACTGCCCCAT TAGTGC-3′，产物大小357 bp。PCR扩增条件：94℃4 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃25 s，35个循环；72℃10 min。按照公式△Ct=Ct（目的基因）-Ct（管家基因）、△△Ct=△Ct（实验组）-△Ct（对照组）计算2-△△C t（pMAP-2 mRNA水平）。

1.5统计学方法应用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1海马、杏仁核组织中MAP-2和pMAP-2蛋白表达水平模型组海马和杏仁核组织pMAP-2蛋白和pMAP-2/MAP-2比值均明显低于对照组，治疗组较模型组升高，但仍低于对照组（均P＜0.05），见图1、表1。

Fig.1　Expressions of pMAP-2 and MAP-2 protein detected by Western blot assay图1　Western blot检测海马和杏仁核MAP-2、pMAP-2蛋白表达

2.2大鼠海马、杏仁核组织中pMAP-2 mRNA的表达模型组大鼠海马和杏仁核pMAP-2 mRNA相对表达量均明显低于对照组，治疗组较模型组升高，但仍低于对照组（均P＜0.05），见表2。

Tab.1　Comparison of MAP-2 and pMAP-2 protein expressions in three groups表13组大鼠海马、杏仁核组织MAP-2和pMAP-2蛋白表达水平比较　（n=5，±s）

Tab.1　Comparison of MAP-2 and pMAP-2 protein expressions in three groups表13组大鼠海马、杏仁核组织MAP-2和pMAP-2蛋白表达水平比较　（n=5，±s）

＊P＜0.05；a与对照组比较，b与模型组比较，P<0.05

组别对照组模型组治疗组F pMAP-2海马0.94±0.11 0.18±0.02a0.43±0.05ab7.68＊杏仁核1.17±0.09 0.62±0.07a1.01±0.06ab11.35＊MAP-2海马1.05±0.12 1.18±0.20a0.71±0.08ab8.77＊杏仁核1.12±0.15 1.02±0.12a1.03±0.08a6.49＊pMAP-2/MAP-2海马0.90±0.11 0.15±0.03a0.61±0.04ab14.92＊杏仁核1.04±0.10 0.61±0.04a0.98±0.09ab8.53＊

3　讨论

抑郁症发病机制及治疗研究成为当前研究的热点内容［7］。由于受到伦理学限制，对抑郁症的基础研究往往通过建立抑郁症动物模型进行，CUMS能模仿人类生活中遭遇的各种应激。研究表明，CUMS应激大鼠能较好地表现出抑郁症的核心临床症状，是被普遍接受的抑郁症大鼠模型［8］。有学者对抑郁症患者海马等部位体积减少原因进行研究，结果表明这可能与这些部位神经凋亡增强以及神经细胞骨架蛋白改变有关［4，9-10］。微管相关蛋白（microtubuleassociated proteins，MAPs）特别是MAP-2能调节微管的聚合状态，在维持神经元形态和突触可塑性方面起主要作用［11］。本课题组既往研究表明，抑郁症大鼠pMAP-2出现先降低后增高的现象［9］。本研究结果表明，抑郁症大鼠海马和杏仁核组织中的pMAP-2表达均较对照组显著降低，可以推测在抑郁症发病过程中，MAP-2的磷酸化是引起抑郁症患者海马、杏仁核体积缩小的一个重要因素。

祖国传统医学对抑郁症有独到认识。中医认为，抑郁症是情志不舒，肝气郁结，渐致五脏不和、化火、生痰、瘀阻、耗气、伤阴等而致，多采用疏肝理气法对其进行治疗［12］。人参是一味名贵中药，具有补气、安神、生津、益智等作用。有研究表明，人参的活性成分人参皂苷Rb1具有明显的抗抑郁作用［5-6］；孙秀萍等［13］研究亦表明，人参总皂苷能明显减轻抑郁小鼠行为学症状，但其抗抑郁的具体作用机制仍不清楚。本研究结果表明，对抑郁症模型大鼠给予人参皂苷Rb1干预后，大鼠海马和杏仁核组织pMAP-2蛋白和mRNA相对表达量均明显升高，提示人参皂苷Rb1可能通过抑制MAP-2磷酸化发挥抗抑郁作用，其具体机制有待于进一步深入研究。

Tab.2　Result of pMAP-2 mRNA expressions in three groups表23组大鼠海马、杏仁核组织pMAP-2 mRNA表达水平比较　（n=5，±s）

Tab.2　Result of pMAP-2 mRNA expressions in three groups表23组大鼠海马、杏仁核组织pMAP-2 mRNA表达水平比较　（n=5，±s）

＊P＜0.05；a与对照组比较，b与模型组比较，P<0.05

组别对照组模型组治疗组F海马1.00±0.00 0.38±0.04a0.75±0.11ab9.57＊＊杏仁核1.00±0.00 0.27±0.05a0.50±0.04ab7.29＊

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（2015-11-04收稿2016-03-18修回）

（本文编辑陈丽洁）

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

DOI：10.11958/20150266

The change of phosphorylated MAP-2 in hippocampus/amygdala and the influence of ginsenoside Rb1 on it in depressive rat model

LIU Jigang1,YUAN Yang2,ZANG Yu2,LIU Hao2△
1 Department of Stomatology,Zunhua Peolple’s Hospital,Zunhua 064200;
2 Department of Neurology,Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology
△Corresponding AuthorE-mail:liuhao938@163.com

Abstract:ObjectiveTo observe effects of ginsenoside Rb1 on phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (pMAP-2)in hippocampus and amygdala of depressive model rats.MethodsThirty male Wistar rats were randomly divided into control group,model group and treatment group.The depression rat model was produced by giving chronic unpredicted mild stress(CUMS).Treatment group was given daily intragastric administration of ginsenoside RB1(1 g/mL crude drug,1 mL/100 g body weight)for 22 days during modeling.Western blot assay was used to detect expressions of MAP-2 and pMAP-2 protein,and real-time PCR was used to detect expressions of pMAP-2 mRNA respectively.Results The expressions of pMAP-2 protein and mRNA in hippocampus and amygdala were significantly lower in model group than those of control group(P<0.05).The expressions of pMAP-2 protein and mRNA were significantly higher in treatment group than those of model group(P<0.05).ConclusionGinsenoside Rb1 can play anti-depression role by inhibiting the phosphorylation of MAP-2 in rats.

Key words:Ginsenoside;depressive disorder;hippocampus;amygdala;microtubule-associated proteins;pMAP-2