整合素αvβ8、p38及ERK1/2在胆道闭锁患儿肝脏中的表达及意义

高婷，詹江华，丁美云，卫园园

整合素αvβ8、p38及ERK1/2在胆道闭锁患儿肝脏中的表达及意义

高婷1，詹江华2△，丁美云1，卫园园1

摘要：目的研究转化生长因子（TGF）-β1通路相关调节蛋白整合素αvβ8、p38及细胞外调节蛋白激酶1/2 （ERK1/2）蛋白在胆道闭锁（BA）患儿肝脏中的表达情况及在肝纤维化进程中的作用。方法选取天津市儿童医院普外科收治的BA患儿15例为Kasai组，胆管扩张症患儿10例为胆扩组；天津市第一中心医院小儿器官移植科行Kasai手术后因肝功能衰竭行肝移植的BA患儿10例为肝移植组。取患儿肝右叶前缘标本，行HE染色观察肝纤维化程度，行免疫组化染色检测αvβ8、p38及ERK1/2在肝组织中的表达情况。结果HE染色示，胆扩组偶见纤维细胞增生；Kasai组汇管区增宽，纤维组织增生、桥接纤维化现象普遍，可见假小叶形成；移植组汇管区明显增宽，纤维组织增生较重，广泛桥接纤维组织形成，假小叶明显。免疫组化染色示，胆扩组αvβ8和ERK1/2表达为弱阳性，p38为阴性表达；Kasai组αvβ8、p38及ERK1/2蛋白均在肝细胞胞质、汇管区胆管上皮细胞胞质及血管内皮细胞胞质中强阳性表达；肝移植组αvβ8、p38及ERK1/2蛋白皆为强阳性表达。Kasai组和肝移植组αvβ8、p38及ERK1/2表达水平明显高于胆扩组（均P＜0.05），Kasai组与肝移植组比较差异无统计学意义。结论αvβ8、p38及ERK1/2表达在BA肝纤维化过程中明显增高，αvβ8、p38及ERK1/2可能参与并促进BA肝纤维进程。

关键词：胆道闭锁；肝硬化；p38丝裂原活化蛋白激酶类；丝裂原活化蛋白激酶1；肝纤维化；αvβ8；p38；ERK1/2

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81570471）；天津市卫生行业重点攻关项目（14KG129）；天津市卫生局科技基金资助项目（2014KR09）

作者单位：1天津医科大学研究生院（邮编300070）；2天津市儿童医院，天津市儿科研究所

作者简介：高婷（1989），女，硕士在读，主要从事小儿普外、胆道闭锁方面的研究

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通讯作者E-mail：zhanjianghuatj@163.com

1　资料与方法

1.1一般资料收集2014年1月—2016年3月间天津市儿童医院普外科收治的BA患儿15例为Kasai组，男4例，女11例，日龄19～112 d，平均（63±28）d；胆管扩张症患儿10例为胆扩组，男3例，女7例，日龄350～1 720 d，平均（820± 681）d；胆扩组及Kasai组均行肝脏活检分别确诊为胆管扩张症及BA患儿，且均行Kasai手术。另收集2013年1月—2014年3月天津市第一中心医院小儿器官移植科行Kasai手术后因肝功能衰竭行肝移植的BA患儿10例为肝移植组，男6例，女4例，日龄215～2 150 d，平均（1 030±499）d。实验用标本取自患儿肝右叶前缘，用10%福尔马林溶液固定8～24 h后，经石蜡包埋储存。本研究经天津市儿童医院及天津市第一中心医院伦理委员会审查通过。

1.2主要试剂与仪器αvβ8抗体购自北京博奥生物技术有限公司；p38、ERK1抗体、二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔聚合物）、3，3-二氨基联苯胺（3，3-diaminobenzidine,DAB）显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ERK2抗体购自Santa Cruz Biotechnology,Inc。定量分析所采用的Image Pro Plus 5.0自动分析系统购自美国Media Cybernetics公司。

1.3组织学检测将蜡块标本连续4 μm切片，分别进行HE染色及免疫组化染色。（1）HE染色。病理切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水洗，浸染苏木素5 min，酸化伊红乙醇液浸染2 min，常规梯度乙醇脱水，透明剂浸泡至透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察肝组织细胞发育、肝纤维化程度。（2）免疫组化染色。病理切片常规脱蜡至水，经枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复15 min，冷却至室温，PBS冲洗5 min×3次，于3%H2O2，37℃中孵育10 min，PBS冲洗5 min×3次，滴加一抗（αvβ8、p38、ERK1、ERK2均为1∶200），于冰箱中4℃过夜，取出置于室温，PBS洗5 min×3次，加辣根过氧化物酶标记的二抗于37℃下孵育30 min，PBS洗5 min×3次，DAB显色5 min，充分水洗，苏木素液染核，常规脱水、透明、中性树胶封片，在低倍镜（×100）下观察切片染色（棕色）区域，高倍镜（×400）下辨别不同阳性细胞及其表达情况。

1.4免疫组化结果判断参照文献［5］免疫组化阳性判断标准。（1）定性分析。高倍镜下计算100个细胞中阳性细胞所占百分比，无阳性细胞为0分，≤10%为1分，11%～50%为2分，＞50%为3分。再根据染色强度定为无棕黄色0分、淡棕黄色1分、棕黄色2分、棕褐色3分。两项评分相加判定结果：0分为阴性，1～2分为弱阳性，3～4分为阳性，5～6分为强阳性。（2）半定量分析。于每张切片阳性部位处读取任意5个视野，用同一计算机成像系统留取100倍显微镜下图片，Image pro-plus 5.0分析图片计算αvβ8、p38、ERK1/2蛋白的平均光密度值（AOD），AOD=肝组织阳性细胞光密度总和/阳性细胞所占面积。

1.5统计学方法采用SPSS 17.0软件包进行统计处理，正态分布的计量资料用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较满足方差齐性采用Bonferroni法，方差非齐性采用Tamhane’s法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1HE染色结果胆扩组偶见纤维细胞增生；Kasai组汇管区增宽，纤维组织增生、桥接纤维化现象普遍，可见假小叶形成；肝移植组汇管区增宽，纤维组织增生较重，广泛桥接纤维组织较重，假小叶明显，见图1。

2.2免疫组化定性分析结果 （1）αvβ8蛋白。在3组肝细胞、汇管区胆管上皮细胞及血管内皮细胞细胞质中均有表达，在胆扩组呈弱阳性表达，在Kasai组和肝移植组呈强阳性表达，见图2A～C。（2）p38蛋白。在胆扩组汇管区胆管上皮细胞及血管内皮细胞呈阴性表达，在Kasai组及肝移植组肝细胞、汇管区胆管上皮细胞及血管内皮细胞胞质中强阳性表达，见图2D～F。（3）ERK1/2蛋白。在胆扩组仅在血管内皮细胞、肝窦周围细胞胞质中有弱阳性表达，在Kasai组及肝移植组不仅在血管内皮细胞、肝窦周围细胞胞质中强阳性表达，还在胆管上皮细胞及肝细胞中呈强阳性表达，见图3。

2.3免疫组化半定量分析结果Kasai组和肝移植组αvβ8、p38和ERK1/2蛋白表达水平均高于胆扩组（均P＜0.05），Kasai组与肝移植组比较差异无统计学意义，见表1。

Tab.1　Comparison of αvβ8,p38 protein and ERK1/2 expressions in liver in three groups表1　3组肝组织αvβ8、p38和ERK1/2蛋白表达水平的比较　　（±s）

Tab.1　Comparison of αvβ8,p38 protein and ERK1/2 expressions in liver in three groups表1　3组肝组织αvβ8、p38和ERK1/2蛋白表达水平的比较　　（±s）

＊P＜0.05；a与胆扩组比较，P＜0.05

组别胆扩组Kasai组肝移植组F n 10 15 10 αvβ8 0.106±0.009 0.147±0.023a0.147±0.012a21.397＊p38 0.103±0.005 0.134±0.018a0.151±0.016a23.121＊ERK1 0.113±0.011 0.133±0.019a0.143±0.018a5.633＊ERK2 0.118±0.018 0.147±0.017a0.156±0.009a10.412＊

3　讨论

BA患儿肝脏以肝内、外胆管梗阻，进行性炎症及肝纤维化为主要病理特征，早期行Kasai手术虽可以改善胆汁淤积，但不能使肝纤维化进程终止［6］。在BA肝纤维化进程中，TGF-β1信号通路蛋白在BA肝纤维化过程中起重要作用，TGF-β1信号通路激活后，诱导肝细胞胞质内Smad2/3磷酸化生成磷酸化-Smad2/3（p-Smad2/3），p-Smad2/3与Smad4形成络合物，并移向细胞核，启动细胞外基质蛋白的基因转录，从而促进肝纤维化进程［2，5］。αvβ8及相关激酶作为TGF-β1信号通路的调节蛋白，在肝纤维化中的作用已有较多研究［3，7］，但其在BA患儿肝脏中的表达情况尚少见报道。

3.1αvβ8参与激活TGF-β1通路来促进BA肝纤维化进展αvβ8作为一种细胞黏附分子，通过与TGF-β1上特定的潜在相关肽-1（latencyassociated peptide-1，LAP-1）区域相结合，然后促进膜型1-基质金属蛋白酶（membrane-type 1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP）与TGF-β1上的LAP-1结合，进而使MT1-MMP 与αvβ8-TGF-β1形成复合物，通过其相互作用，激活TGF-β1信号通路［8-9］。本研究中αvβ8蛋白在3组中均有阳性表达，主要在肝细胞、汇管区胆管上皮细胞及血管内皮细胞细胞质中表达，但在胆扩组呈弱阳性表达，在Kasai组及肝移植组呈强阳性表达；Kasai组及肝移植组αvβ8蛋白表达水平较胆扩组高。另外，胆扩组偶见纤维细胞增生，而Kasai组和肝移植组纤维组织增生较重，提示αvβ8在肝纤维化过程中表达增多，可能参与BA肝纤维化进程。本研究与Iordanskaia等［10-11］的研究结果一致。本研究中Kasai组αvβ8蛋白表达水平与肝移植组无明显差异，这可能与肝移植组选材时所处的肝纤维化分级情况及样本量有关。3.2p38、ERK1/2通过参与TGF-β1信号通路相关蛋白磷酸化及核易位过程促进肝纤维化进程p38、ERK1/2是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路中的不同亚型，Jiang等［12］研究结果显示p38、ERK1/2抑制剂通过阻断Smad2/3磷酸化及p-Smad2/3与Smad4核易位，进而阻断Smad2/3/4复合物形成，导致PAI-1蛋白及mRNA表达降低，提示MAPK信号蛋白参与并促进肝纤维化进程，目前MAPK信号通路在BA患儿肝脏中的表达属于较新的研究领域。本研究结果显示，p38、ERK1/2在BA患儿肝脏中肝细胞胞质、汇管区胆管上皮细胞及血管内皮细胞胞质等中强阳性表达，且其表达水平较对照组明显增高，提示其可能在BA肝纤维化进程中起重要作用；而Kasai组与肝移植组比较差异虽无统计学意义，但在数值上较Kasai组高，提示p38、ERK1/2可能与肝纤维化严重程度有关，但尚需进一步研究验证。

综上所述，αvβ8、p38和ERK1/2表达在BA肝纤维化过程中明显增高，αvβ8通过激活TGF-β1信号通路，进而促进肝纤维化进程；p38、ERK1/2通过影响TGF-β1信号通路蛋白磷酸化及核易位来促进肝纤维化进程。

（图1～3见插页）

参考文献

［1］Neto JS，Feier FH，Bierrenbach AL，et al.Impact of Kasai portoen⁃terostomy on liver transplantation outcomes：a retrospective cohort study of 347 children with biliary atresia［J］.Liver Transpl，2015，21（7）：922-927.doi：10.1002/lt.24132.

［2］Ding MY，Zhan JH，Zhao L，et al.The function of TGF-β1 and Smad2 in liver fibrosis of biliary atresia［J］.Tianjin Med J，2016，44（7）：810-813.［丁美云，詹江华，赵丽，等.TGF-β1、Smad2在胆道闭锁肝纤维化中的作用［J］.天津医药，2016，44（7）：810-813］.doi：10.11958/20150242.

［3］Farrington C，Novak D，Liu C，et al.Immunohistochemical localization of transforming growth factor β-1 and its relationship with collagen expression in advanced liver fibrosis due to biliary atresia［J］.Clin Exp Gastroenterol，2010，3：185-191.doi：10.2147/CEG.S14220.

［4］Jafri M，Donnelly B，McNeal M，et al.MAPK signaling contributes to rotaviral-induced cholangiocyte injury and viral replication［J］. Surgery，2007，142（2）：192-201.doi：10.1016/j.surg.2007.03.008.

［5］Kamato D，Burch ML，Piva TJ，et al.Transforming growth factor-β signaling：roleandconsequencesofSmadlinkerregion phosphorylation［J］.Cell Signal，2013，25（10）：2017-2024.doi：10.1016/j.cellsig.2013.06.001.

［6］Zhan JH.The early screening and countermeasures of biliary atresia ［J］.Tianjin Med J，2015，43（1）：1-3.［詹江华.胆道闭锁早期筛查现状及对策［J］.天津医药，2015，43（1）：1-3］.doi：10.3969/j. issn.0253-9896.2015.01.001.

［7］Mu D，Cambier S，Fjellbirkeland L，et al.The integrin alpha（v）beta8 mediates epithelial homeostasis through MT1-MMP-dependent activation of TGF-beta1［J］.J Cell Biol，2002，1579（3）：493-507.doi：10.1083/jcb.200109100.

［8］van der Flier A，Sonnenberg A.Function and interactions ofintegrins［J］.Cell Tissue Res，2001，305（3）：285-298.

［9］Holmbeck K，Bianco P，Caterina J，et al.MT1-MMP-deficient mice develop dwarfism，osteopenia，arthritis，and connective tissue disease due to inadequate collagen turnover［J］.Cell，1999，99（1）：81-92.doi：10.1016/S0092-8674（00）80064-1.

［10］Iordanskaia T，Koeck E，Rossi C，et al.Integrinβ-8，but not β-5 or-6，protein expression is increased in livers of children with biliary atresia［J］.J Pediatr Gastroenterol Nutr，2014，59（6）：679-683.doi：10.1097/MPG.0000000000000518.

［11］Iordanskaia T，Hubal MJ，Koeck E，et al.Dysregulation of upstream and downstream transforming growth factor-β transcripts in livers of children with biliary atresia and fibrogenic gene signatures［J］.J Pediatr Surg，2013，48（10）：2047-2053.doi：10.1016/j.jpedsurg.2013.03.047.

［12］Jiang Y，Wu C，Boye A，et al.MAPK inhibitors modulate Smad2/3/ 4 complex cyto-nuclear translocation in myofibroblasts via Imp7/8 mediation［J］.Mol Cell Biochem，2015，406（1/2）：255-262.doi：10.1007/s11010-015-2443-x.

（2016-04-27收稿2016-05-12修回）

（本文编辑陈丽洁）

中图分类号：R726.1

文献标志码：A

DOI：10.11958/20160362

The expression and significance of integrin αvβ8,p38 and ERK1/2 in the liver of children with biliary atresia

GAO Ting1，ZHAN Jianghua2△，DING Meiyun1，Wei Yuanyuan1
1 The Graduate School of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;
2 Tianjin Children’s Hospital,Tianjin Pediatrics Institute△Corresponding AuthorE-mail：zhanjianghuatj@163.com

Abstract：ObjectiveTo investigate the expression and significance of integrin αvβ8,p38 and extracellular signalregulated protein kinase 1/2(ERK1/2)proteins,which are TGF-β1 pathway related regulatory protein,in liver fibrosis of children with biliary atresia(BA).MethodsFifteen cases of BA(Kasai group)and 10 cases of congenital biliary dilatation (CBD group)were collected in Tianjin Children’s Hospital.And liver biopsy specimens were collected in Tianjin first central hospital,including 10 cases of BA children who underwent liver transplantation due to liver failure after Kasai operation (liver transplantation group).The specimens of front part of the right lobe of the liver were taken for HE and immunohistochemistry(IHC)staining.The expressions of αvβ8,p38 and ERK1/2 in liver were observed by IHC staining in three groups of liver tissues.ResultsHE staining showed fibroblast hyperplasia occasionally in CBD group,portal area expansion,fibrous tissue proliferation and wide spread bridging fibrosis with few pseudo lobules in Kasai group.In transplantation group,portal area was widened,the degree of fibrosis was severe and bridging fibrosis generally formed resulted in pseudo lobules widely.Imunohistochemistry showed that the expressions of αvβ8 and ERK1/2 were weakly positive,and the expression of p38 was negative in CBD group.In Kasai group,the expressions of αvβ8,p38 and ERK1/2 proteins were all strongly positive in liver cytoplasm,biliary epithelial cells and vascular endothelial cell cytoplasm.In liver transplantation group the expressions of αvβ8,p38 and ERK1/2 proteins were all strongly positive.The semi-quantitative analysis showed that the expressions levels of αvβ8,p38 and ERK1/2 were significantly higher in Kasai and liver transplantation groups than those of CBD group(P<0.05).There were no significant differences in expression levels of αvβ 8,p38 and ERK1/2 between Kasai group and transplantation group(P>0.05).ConclusionThe expressions of αvβ8,p38 and ERK1/2 are gradually increased in liver of BA with the process of fibrosis,which indicate that they may be involved inthe process of BA liver fibrosis.

Key words:biliary atresia;liver cirrhosis;p38 mitogen-activated protein kinases;mitogen-activated protein kinase 1; liver fibrosis;αvβ8;p38;ERK1/2胆道闭锁（biliary atresia，BA）是婴幼儿期最严重的肝胆系统疾病之一，主要以肝内外胆管进行性炎症、纤维性梗阻及胆汁淤积为特点，导致进行性肝纤维化和肝硬化，如不及时治疗，常在1岁左右死亡［1］。目前BA的主要治疗方法为早期行肝门-空肠吻合术（Kasai手术），但肝纤维化进程并不随着 Kasai手术而停止。转化生长因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）通路与肝纤维化进程密切相关，而整合素αvβ8、p38及细胞外调节 蛋白 激 酶 1/2（extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2）对 TGF-β1通路的激活及Smad2/3蛋白磷酸化等起重要作用［2-4］。但以上3种蛋白在BA肝组织中的表达情况尚不明确，本文旨在检测αvβ8、p38及ERK1/2在BA肝组织中的表达情况，并探讨其在BA肝纤维化中的作用机制。