MEF2D在肺癌中的表达及其在肺癌细胞增殖与转移中的作用

张秀芳　孙　莹　赵　丹　白小雪　魏　静　华树成

(吉林大学白求恩第一医院呼吸科，吉林　长春　130021)



MEF2D在肺癌中的表达及其在肺癌细胞增殖与转移中的作用

张秀芳孙莹赵丹白小雪魏静华树成

(吉林大学白求恩第一医院呼吸科，吉林长春130021)

目的研究MEF2D在肺癌中的表达及其对肺癌细胞生物学行为的影响。方法收集30例肺癌组织标本，通过qPCR实验、蛋白免疫印迹实验和细胞免疫荧光实验检测MEF2D在肺癌组织和肺癌细胞系中的表达；通过细胞增殖实验和Transwell实验观察在敲除和过表达MEF2D后，肺癌细胞的增殖及转移能力。结果与癌周正常组织相比，肺癌组织中MEF2D mRNA表达水平显著提高(P<0.01)，肺癌细胞系(A549、H460、H1229)中MEF2D表达含量与正常肺成纤维细胞MRC-5相比含量升高(P<0.01)。与普通肺癌细胞相比，敲除了MEF2D的肺癌细胞增殖率下降，细胞转移能力降低；与对照组相比，过表达MEF2D的MRC-5增殖率升高，转移能力增强(P<0.01)。结论MEF2D在肺癌组织和肺癌细胞中高表达，且能促进肺癌的增殖及转移

肺癌；MEF2D；增殖；转移

目前肺癌发生、发展的分子机制还没有得到完全阐明，因此临床治疗无法明显提高肺癌患者生存率。近年来，人们发现转录因子-肌细胞增强因子2家族(MEF2)在肿瘤中起着重要的作用。本文拟检测MEF2D对肺癌细胞和正常成纤维细胞增殖、抗凋亡及转移能力的影响，为肺癌的临床诊断与治疗提供理论依据。

1　材料和方法

1.1实验细胞和标本来源A549、H460、H1229肺癌细胞和正常肺成纤维细胞MRC-5、人皮肤成纤维细胞BJ购买于American Type Culture Collection(ATCC)。全部细胞株均按照说明书推荐条件下，培养在37℃和5%CO2环境中，培养基为含10%胎牛血清的DMEM完全培养基。收集2012年8月至2014年8月吉林大学白求恩第一医院住院肺癌患者30例，将手术切下的肺癌及癌周组织放置于-80℃冰箱待用。

1.2主要试剂和仪器MEF2D 一抗、FITC 标记二抗：BD公司；对照质粒pcDNA-GFP：Addgene；CFX96 实时荧光定量检测系统：Bio-Rad Laboratories；TaqMan®2×Universal PCR Master Mix 试剂：Applied Biosystems；Trizol:Invitrogen；Rever Tra Ace qPCR RT 试剂盒：日本东洋；Mammalian Protein Extraction Reagent：Thermo；GAPDH 一抗：CST公司；Scepter Handheld Automated：Millipore；ChemiDox XRS imaging system：Bio-RAD；FITC标记的 Annexin V/PI凋亡染色试剂盒：BioVision；流式细胞仪(FACS Aria II Cell Sorter)：BD公司。

1.3实验方法

1.3.1细胞免疫荧光标记分别将2×104个A549细胞和2×104个MRC-5细胞在小玻璃片上培养24 h，用70%的酒精固定1 h。依次加入 MEF2D 抗体(1∶200)和 FITC 标记二抗(稀释浓度为1∶5 000)，DAPI(1∶10 000)染核。利用免疫荧光显微镜观察荧光的显色情况。Image J 软件进行荧光定量。

1.3.2实时定量PCR按照制造商提供的操作流程用Trizol提取RNA,应用 Rever Tra Ace qPCR RT试剂盒，参照制造商提供的操作流程将得到的RNA分子反转录成 cDNA。应用TaqMan®2 × Universal PCR Master Mix 试剂及 CFX96TM实时 PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories,CA)进行qPCR检测。

1.3.3蛋白免疫印迹实验用M-PER试剂盒提取总蛋白，将获得的总蛋白用SDS-PAGE分离并转膜到0.45 μm硝酸纤维醋膜上，用含有5%BSA的PBS封闭后，分别用MEF2D 一抗(1∶1 000)和GAPDH 一抗(1∶2 000)孵育，接着用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育硝酸纤维醋膜，最后在显像系统(ChemiDox XRS imaging system)下显像蛋白条带。

1.3.4细胞增殖能力检测siMEF2D 和对照组siRNA分别转染3×103个A549肺癌细胞和3×103个H460肺癌细胞，pcDNA-MEF2D 和对照组pcDNA-GFP分别转染3×103个MRC-5正常肺成纤维细胞，所有细胞接种在96孔板中。经过特定时间后用Scepter Handheld Automated计数法来检测各孔的细胞数目。

1.3.5细胞凋亡能力检测将2×105个A549，H460和 MRC-5细胞分别种在6孔板中，用慢病毒MEF2D载体进行转染。48 h后，按照试剂厂家推荐步骤用FITC标记的 Annexin V/PI染色细胞，通过流式细胞仪检测细胞凋亡状况。

1.3.6细胞侵袭能力(Transwell实验)检测将各1×103个已经转染过MEF2D siRNA 或 pcDNA-MEF2D的A549、H460、 MRC-5细胞和相应的对照组细胞种植在预先处理的Matrigel胶上，然后分别用 300 μl 和 200 μl培养基加入小室下方和上方。 24 h后，用0.1%的结晶紫染色，经过漂洗干燥，于显微镜下观察细胞染色情况。计数随机选取10个区域(×200)的浸润细胞。

1.4统计学方法采用SPSS21.0统计软件进行t检验或方差分析。

2　结　果

2.1MEF2D在肺癌中过表达通过qPCR来检测MEF2家族成员MEF2A、2B、2C和2D在肺癌组织(n=30)中的表达情况，结果发现，与正常肺部组织(1.0±0.22)相比，肺癌组织中的MEF2D mRNA表达量(2.1±0.55)显著提高(P=1.88×10-5)。肺癌组织中MEF2A mRNA和MEF2C mRNA的表达含量(1.2±0.41，1.0±0.34)与正常肺部组织(1.0±0.36，1.0±0.32)相比无统计学差异(P=0.352、P=0.189)。肺癌组织和正常肺部组织中没有检测到MEF2B的表达。Western印迹实验进一步验证了在肺癌组织和A549、H460、H1229肺癌细胞中，MEF2D的表达水平明显高于正常肺部组织和正常肺成纤维细胞(图1A)。免疫荧光染色实验发现MEF2D主要定位在A549细胞核内，正常的肺成纤维细胞中，MEF2D主要定位于细胞质中(图1B)。

图1　MEF2D在肺癌中过表达

2.2过表达MEF2D对正常肺部细胞增殖和转移的影响见图2。为了进一步了解MEF2D的生物学行为，将表达MEF2D的质粒(pcDNA-MEF2D)转染入正常肺纤维母细胞MRC-5中，使MEF2D 在MRC-5细胞过高表达，蛋白免疫印迹实验进一步验证转染pcDNA-MEF2D 的MRC-5细胞MEF2D的表达水平与对照组相比升高(图2A)。增殖实验检测高表达MEF2D的MRC-5细胞的增殖能力，结果发现与转染GFP的对照组相比，转染pcDNA-MEF2D 的MRC-5细胞增殖率升高(图2B)。另外，Transwell实验进一步提示高表达MEF2D 的MRC-5细胞，侵袭能力与对照组相比增高(图2C)。BrdU 实验 和 ki67检测也提示在正常肺成纤维细胞MRC-5中 MEF2D过表达其增殖率也增加(图2A和2D)。

2.3敲除MEF2D对肺癌细胞增殖和转移的影响靶向针对MEF2D的 siRNA(MEF2D siRNA)分别转染A549肺癌细胞和 H460肺癌细胞，来敲除A549肺癌细胞和 H460肺癌细胞中的MEF2D，蛋白免疫印迹实验进一步验证敲除了MEF2D的A549肺癌细胞和 H460肺癌细胞与对照组相比MEF2D表达水平下降(图3A)。同时对该敲除MEF2D的A549肺癌细胞和 H460肺癌细胞进行增殖能力的检测，实验结果发现与对照组相比其增殖率都有所降低(图3B)。另外，与对照组相比两种细胞凋亡率同时也增高(图3C)。Transwell实验进一步证明了敲除掉MEF2D后，A549、H460肺癌细胞侵袭能力与对照组相比降低(图3D)。 敲除MEF2D的A549、H460肺癌细胞与对照组相比增殖率降低(图3E)。以上所有的实验结果都证明抑制MEF2D表达能够减少肺癌细胞的增殖以及转移。

图2　过表达MEF2D对正常肺部细胞增殖和转移的影响

图3　敲除MEF2D对肺癌增殖、存活和转移的影响

3　讨　论

MEF2属于转录因子MADS-box调节家族，最早发现于骨骼肌管的一种蛋白质，在脊椎动物中，MEF2家族包括了MEF2A、MEF2B.MEF2C和MEF2D四个成员〔1〕。已有研究表明，MEF2C和 MEF2D能分别促进VEGF信号通路的活化及增加细胞增殖能力，对肝细胞癌(HCC)的发生发展中具有非常重要的意义〔2，3〕。另有研究阐明，HCC的侵袭以及转移能力增加是由于MEF2蛋白表达的加强，增加TGF-β1的表达来完成这种作用的〔4〕。MEF2家族除了在实体肿瘤中的作用，白血病的发生中也被证明与其有联系〔5～7〕。另外，Zhao等〔8〕提出，一种抑制细胞活性的天然抗菌素混合物齐墩果酸，能够在肺癌细胞中促进miR-122的产生，的并能够抑制miR-122的下游靶点 CCNG1 和 MEF2D的表达。这个发现意味着MEF2家族可能和肺癌存在着某些联系。

但是到目前为止，仍然缺乏有效的实验证据来明确这种联系。在本研究中，MEF2D主要定位于肺癌细胞系的细胞核内，这进一步表明MEF2D在肺癌中是异常高表达的。另外，已有较多的证据表明，在神经元细胞中MEF2D促进细胞存活〔9～11〕。本研究结果发现低表达MEF2D的肺癌细胞其增殖与转移能力是降低的。另外在过表达MEF2D的正常肺成纤维细胞中，细胞的增殖与转移能力却是增加的。从而提示我们MEF2D在肺癌中高表达，且能够促进肺癌的增殖与转移。

本研究首次证明了MEF2D在肺癌中的抗凋亡作用，这为靶向针对MEF2家族成员转录因子的肺癌治疗提供了新的理论依据。MEF2D在肺癌组织中高表达，且能促进肺癌细胞的增殖与转移，提示MEF2D有可能成为肺癌治疗的又一靶点，靶向针对MEF2家族成员转录因子治疗有可能成为肺癌治疗的新方向。但是MEF2D在肺癌中抗凋亡的具体分子机制还需要我们进一步的探索。

1程波，李利，王林杰，等.MEF2 基因家族的研究进展〔J〕.中国畜牧杂志,2012;48(15):70-4.

2Bai XL,Zhang Q,Ye LY,etal.Myocyte enhancer factor 2C regulation of hepatocellular carcinoma via vascular endothelial growth factor and Wnt/beta-catenin signaling〔J〕.Oncogene,2014;34(31):4089-97.

3Ma L,Liu J,Liu L,etal.Overexpression of the transcription factor MEF2D in hepatocellular carcinoma sustains malignant character by suppressing G2-M transition genes〔J〕.Cancer Res,2014;74(5):1452-62.

4Yu W,Huang C,Wang Q,etal.MEF2 transcription factors promotes EMT and invasiveness of hepatocellular carcinoma through TGF-beta1 autoregulation circuitry〔J〕.Tumour Biol,2014;35(11):10943-51.

5Cante-Barrett K,Pieters R,Meijerink JP.Myocyte enhancer factor 2C in hematopoiesis and leukemia〔J〕.Oncogene,2014;33(4):403-10.

6Lilljebjorn H,Agerstam H,Orsmark-Pietras C,etal.RNA-seq identifies clinically relevant fusion genes in leukemia including a novel MEF2D/CSF1R fusion responsive to imatinib〔J〕.Leukemia,2014;28(4):977-9.

7Prima V,Hunger SP.Cooperative transformation by MEF2D/DAZAP1 and DAZAP1/MEF2D fusion proteins generated by the variant t(1;19)in acute lymphoblastic leukemia〔J〕.Leukemia,2007;21(12):2470-5.

8Zhao X,Liu M,Li D.Oleanolic acid suppresses the proliferation of lung carcinoma cells by miR-122/Cyclin G1/MEF2D axis〔J〕.Mol and Cell Biochem,2015;400(1-2):1-7.

9Ma L,Liu J,Shen J,etal.Expression of miR-122 mediated by adenoviral vector induces apoptosis and cell cycle arrest of cancer cells〔J〕.Cancer Biol Ther,2010;9(7):554-61.

10Davidson MR,Larsen JE,Yang IA,etal.MicroRNA-218 is deleted and downregulated in lung squamous cell carcinoma〔J〕.PloS One,2010;5(9):e12560.

11Sher YP,Wang LJ,Chuang LL,etal.ADAM9 up-regulates N-cadherin via miR-218 suppression in lung adenocarcinoma cells〔J〕.PloS One,2014;9(8):e94065.

〔2015-12-31修回〕

(编辑李相军)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.020

华树成(1961-)，男，教授，博士生导师，主要从事呼吸系统的病毒感染、炎症与防御反应研究。

张秀芳(1989-)，女，在读硕士，主要从事呼吸系统的病毒感染、炎症与防御反应研究。

R562.2

A

1005-9202(2016)14-3397-04；