Aβ蛋白淀粉样变成分在正常人血小板膜的表达

李晓亮　兰　杰　葛　鹏　苏桂新　赵　琢　卢金海　郑　芳　孙续国

(天津医科大学医学检验学院，天津　300203)



Aβ蛋白淀粉样变成分在正常人血小板膜的表达

李晓亮兰杰葛鹏苏桂新赵琢1卢金海1郑芳孙续国

(天津医科大学医学检验学院，天津300203)

目的探讨正常人血小板中是否存在Aβ蛋白淀粉样变成分。方法筛选正常人群340例，采用Sysmex-200型血细胞分析仪测定血液血小板数量(PLT)、血小板分布宽度(PDW)、平均血小板体积(MPV)、血小板比容(PCT)和大型血小板比例(P-LCRs)，进一步提纯血小板，将血小板分成两部分，一部分用于提取血小板膜蛋白，另一部分用硫磺素T(ThT)荧光探针检测血小板膜上淀粉样变。抗Aβ抗体检测淀粉样变前多肽的免疫反应。Western印迹观察Aβ蛋白分子聚合。结果ThT荧光探针检测血小板几乎全部显示阳性反应。进一步抗Aβ免疫组织化学实验发现绿色荧光与Aβ抗体反应阳性部位重叠。SDS-PAGE分析血小板提取的蛋白成分含有大分子Aβ聚合物。结论正常人血小板中存在Aβ淀粉样变成分，可能参与AD患者淀粉样变的发生。

淀粉样变；血小板；探针；荧光

阿尔茨海默病(AD)患者脑组织和血管中有大量淀粉样变沉积，且证实淀粉样变成分为Aβ多肽〔1〕，最近报道血液中Aβ多肽主要来源于血小板，血小板可能参与AD淀粉样变的形成〔2〕。淀粉样前体蛋白(APP)形成淀粉样变，血液中存在Aβ成分，多数学者主张，利用硫磺素T(ThT)探针能够检测淀粉样变聚合物和淀粉样变纤维成分，本组已经多次发表论文显示，T荧光探针能够清晰与淀粉样变结合〔3,4〕，结果提示与淀粉样变结合特异，用于确定淀粉样变成分。利用淀粉样变荧光探针研究分析血小板淀粉样变成分，进一步结合抗Aβ免疫组织化学确定淀粉样变类型，为解析AD淀粉样变形成的分子机制奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料收集志愿者340例，均经过天津医科大学附属医院实验检查和临床检查，无肝肾心脑代谢病等疾病，按年龄分为0～20岁和60～80岁两组，采集EDTA抗凝血4 ml用于血小板分析，血液2 ml分离血浆用于生物化学标志物检测。

1.2血小板分离试剂、血小板膜蛋白成分的分离利用Sysmex-100型血细胞分析仪(希森美康，日本)及配套试剂按照说明进行操作，测定末梢血液血小板计数(PLT)、血小板分布宽度(PDW)、平均血小板体积(MPV)、血小板比容(PCT)和大型血小板比例(P-LCRs)指标。分离血小板，抗凝血离心(15 min)，取上层富含血小板血浆(PRP),然后离心(15 min),去掉上清血浆，底部沉淀即为血小板，收集血小板，制备血小板涂片，配制0.1 mol/L硫磺素T(ThT)溶液，溶液与血液的比例为3∶1，室温作用5 min，利用荧光显微镜判定淀粉样变荧光〔5〕。

1.3Western印迹法测定血小板膜中Aβ成分分别用两组不同年龄段(0～20岁、60～80岁)研究对象血浆、血小板膜蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹分析4%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，考马斯亮蓝溶液对蛋白进行染色。免疫印迹实验，鼠抗A单克隆抗体孵育60 min，10 mmol/L PBS(pH7.4)缓冲液洗涤，酶标记二抗体孵育60 min，多色荧光化学发光系统(CE)成像。

1.4统计学方法采用SPSS11.0统计学软件、组间比较进行t检验。

2　结　果

2.1血小板数量及血小板指数分析老年人PLT明显减少(P<0.05)，而其余四项指标在成熟末梢血小板中未见有统计学差异(P>0.05)，见表1。

2.2利用ThT探针分析血小板淀粉样变成分荧光探针显示所有研究对象的血小板均存在荧光染色阳性，见图1。

2.3Western印迹检测Aβ淀粉样变提取分离血小板的膜蛋白成分，经过SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色结合抗Aβ抗体免疫反应，发现血浆中存在淀粉样变蛋白，血小板膜中Aβ蛋白反应阳性，在43 kD和22 kD附近出现蛋白分子带，提示有Aβ聚合物的存在，见图2。

表1　不同年龄组末梢血血小板相关指标比较±s)

A：可见光观察血小板(箭头所示)；B：ThT荧光，箭头所示ThT染色血小板图1　荧光显微镜观察ThT荧光染色(×400)

A、B：分别加入0～20岁和60～80岁血浆样本；C、D：0～20岁和60～80岁血小板膜蛋白标本图2　Western印迹分析血小板膜Aβ多肽成分

3　讨　论

研究表明Aβ来自其前体蛋白APP〔6〕，通过β和 γ分泌酶作用于APP，产生各种长度Aβ片段和一个较小的碳末端片段(CTFγ)〔7〕。人类血小板表达所有APP形成Aβ的酶，血小板可能通过细胞内信号激活参与AD淀粉样变的形成。最近报道血小板通过自身生物功能参与AD患者淀粉样变形成〔8〕，但是未明确是否参与淀粉样变形成。探讨血小板来源Aβ是否参与AD患者淀粉样变形成将有利于解析其淀粉样变形成的分子机制。前期我们报道了测定组织淀粉样变的方法〔9〕，为分析细胞淀粉样变奠定了技术基础。本文发现血小板膜中存在与Aβ抗体发生免疫反应区带，分子量明显高于(Aβ40、Aβ42)多肽，提示存在Aβ集合分子，血小板特异性荧光染色阳性，说明血小板存在淀粉样变成分。

1Hampel H,Shen Y,Walsh DM,etal.Biological markers of amyloid beta-related mechanisms in Alzheimer's disease〔J〕.Exp Neurol,2010;223(2):334-46.

2Randriamboavonjy V,Sopova K,Stellos K,etal.Platelets as potential link between diabetes and Alzheimer's disease〔J〕.Curr Alzheimer Res,2014;11(9):862-8.

3孙续国，刘金平，王庆艳，等.过氧化修饰与淀粉样沉积形成〔J〕.中国煤炭工业杂志，2007；10(12)：1345-7.

4兰杰，李晓亮，薛蓉，等.AD患者血浆淀粉样变程度、血清总胆固醇水平、全血黏度变化及其相关性〔J〕.山东医药，2014；27(54)：11-3,17.

5Meyer-Luehmann M,Spires-Jones TL,Prada C,etal.Rapid appearance and local toxicity of amyloid-beta plaques in a mouse model of Alzheimer's disease〔J〕.Nature,2008；451(179):720-4.

6Dobrowolska JA,Kasten T,Huang Y,etal.Diurnal patterns of soluble amyloid precursor protein metabolites in the human central nervous system〔J〕.PLoS One,2014;9(3):e89998.

7Purandare N,Burns A,Morris J,etal.Association of cerebral emboli with accelerated cognitive deterioration in Alzheimer's disease and vascular dementia〔J〕.Am J Psychiatry,2012；169(3):300-8.

8Plagg B,Marksteiner J,Kniewallner KM,etal.Platelet dysfunction in hypercholesterolemia mice,two Alzheimer's disease mouse models and in human patients with Alzheimer's disease〔J〕.Biogerontology,2015;16(4):543-58.

9赵辉,潘涛,胡可胜,等.老年性关节病变关节组织内发现TTR淀粉样变〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(2)：239-41.

〔2016-01-07修回〕

(编辑苑云杰/曹梦园)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.080

国家自然科学基金(30973157)

孙续国(1965-)，男，教授，博士，博士生导师，主要从事淀粉样变的发病机制与分子诊断的研究。

李晓亮(1988-)，男，硕士，主要从事血小板淀粉样变成分的研究。

R741.03

A

1005-9202(2016)14-3524-02；

1天津检验检疫理化检验中心