CD40单克隆抗体枝联聚乳酸体外扩增树突状细胞的应用

陈艳飞+顾春森+刘宏侠

【摘要】 目的 研究聚乳酸枝联CD40单克隆抗体在树突状细胞（DC）培养中的作用， 从而对三维立体培养有深入的认识， 为体外扩增树突状细胞提供新思路。方法 利用鼠抗人CD40单克隆抗体对DC的诱导效应， 观察聚乳酸枝联CD40单克隆抗体诱导的树突状细胞数量及生物学功能变化。结果 与对照组普通悬液培养体系树突状细胞数量（5.43±33.31）×108比较， 实验组三维立体培养系统树突状细胞数量（8.22±25.25）×108扩增（P<0.05）。实验组三维立体培养系统在6、9 d促进人树突状细胞分泌白细胞介素-12b（IL-12b）量高于对照组（P<0.05）。与对照组比较， 实验组更加能促进人树突状细胞的成熟， 促进其表面共刺激分子表达水平上调。结论 通过CD40单克隆抗体与聚乳酸支架枝联建立的三维立体培养系统， 有利于树突状细胞数量的扩增及其功能的增进。

【关键词】 CD40单克隆抗体；聚乳酸支架；三维立体培养系统；树突状细胞

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.25.198

【Abstract】 Objective To research effect by polylactic acid scaffold combined with CD40 monoclonal antibody in dendritic cell （DC） culture， in order to get further knowledge of three-dimensional culture， and to provide new thoughts for dendritic cell expansion in vitro. Methods Dendritic cell count and changes of biological function in olylactic acid scaffold combined with CD40 monoclonal antibody induction were observed in accordance with inductive effect by mouse anti-human CD40 monoclonal antibody on DC. Results Comparing with （5.43±33.31）×108 of dendritic cell count in control group by common suspension culture system， experimental group had expansion of dendritic cell count as （8.22±25.25）×108 by three-dimensional culture system （P<0.05）. Experimental group had higher interleukin-12b （IL-12b） level in dendritic cell accelerated by three-dimensional culture system in 6 and 9 d than control group （P<0.05）. Comparing with control group， experimental group accelerated dendritic cell maturation and increased surface costimulatory molecules level. Conclusion Three-dimensional culture system established by combination of CD40 monoclonal antibody and bolylactic acid scaffold is helpful for dendritic cell expansion and function enhancement.

【Key words】 CD40 monoclonal antibody； Polylactic acid scaffold； Three-dimensional culture system； Dendritic cell

近年来， 组织工程方面的研究得到了突飞猛进的发展， 聚乳酸由丙交酯开环聚合制备， 具有无毒、可靠的生物安全性， 被美国FDA批准用于临床， 是迄今研究最广泛、应用最多的可降解生物材料[1]。DC在外周血中含量极低， 在抗肿瘤免疫中发挥重要作用[2]。因此人们试图体外大量培养扩增出有功能的DC制备成疫苗， 达到治疗疾病的目的[3]。在本文中， 作者通过CD40单克隆抗体与聚乳酸支架进行枝联探讨三维立体培养系统体外扩增DC的应用。现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 将需要扩增的50份DC按培养皿随机分为对照组和实验组， 各25份。对照组采用普通悬液培养体系， 实验组采用三维立体培养系统进行体外扩增DC。

1. 2 仪器与试剂 电纺技术制备聚乳酸薄膜支架；CD40单克隆抗体5C11（苏州大学）；GM-CSF、rmIL-4（美国R&D公司）；荧光抗体及同型对照抗体（美国Beioscineec公司）；BD FACSAria II流式细胞分选仪（美国Becton Dickinson公司）。

1. 3 实验方法

1. 3. 1 DC的诱导 采集健康人外周血， 用密度梯度离心分离得到单个核细胞， 置于DC培养基中培养， 2 h后去除非贴壁细胞， 贴壁生长的细胞中分为两组， 对照组加入细胞因子GM-CSF、rmIL-4和5C11， 实验组加入GM-CSF、rmIL-4以及预先枝联5C11的聚乳酸支架， 分别建立二维及三维培养系统， 每3天更换一次培养基， 8～10 d收集树突状细胞。

1. 3. 2 DC检测 ①流式细胞仪检测DC表型及其计数。②利用酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测培养上清中的IL-12b含量。

1. 4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 两组树突状细胞数量的比较 与对照组普通悬液培养体系树突状细胞数量（5.43±33.31）×108比较， 实验组三维立体培养系统树突状细胞数量（8.22±25.25）×108扩增， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2. 2 两组树突状细胞分泌IL-12b比较 与对照组普通悬液培养体系比较， 实验组三维立体培养系统在6、9 d促进人树突状细胞分泌IL-12b量高于对照组， 差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2. 3 两组树突状细胞成熟度和表面共刺激分子表达比较 与对照组普通悬液培养体系相比， 实验组三维立体培养系统更加能促进人树突状细胞的成熟， 促进其表面共刺激分子表达水平上调。见图1， 图2。

3 讨论

聚乳酸（PLA）为多个乳酸分子脱水缩合而成， 也称为聚丙交酯。生产过程无污染， 产品可以生物降解， 是理想的绿色高分子材料。聚乳酸薄膜具有优异的生物相容性、生物可降解性、良好的透气性、透氧性及透二氧化碳性， 是唯一具有优良抑菌及抗霉特性的生物可降解塑料。大多数哺乳动物的细胞都是固着型的细胞， 如果不给其提供一个附着的基质， 其就难以存活， 聚乳酸可提供支架作用， 其满足组织工程材料的性能要求， 如无毒及组织相容性；高孔隙率且内部联通的三维结构；可控生物降解性和生物吸收性等， 是良好的组织工程材料[4]。

CD40/CD40L是免疫应答及其调控过程中重要共刺激信号， 为正常B淋巴细胞增殖、分化、发育、成熟提供重要的辅助信号， 促进B细胞抗体分泌及其类型转换， 介导DC细胞的激发及分化成熟， 内皮细胞黏附分子的改变， 炎症因子的释放等生理功能[5-7]。鉴于CD40分子广泛的生物学效应， 研制了多株功能性抗体， 如应用于预防及治疗多发性硬化症的5D12、预防及治疗同种异体移植排斥的Chi220以及用于治疗肿瘤的多株单克隆抗体等。

综上所述， 通过CD40单克隆抗体枝联聚乳酸支架体外扩增树突状细胞， 有利于DC数量的扩增及其功能的增进， 为体外大量扩增DC提供了新思路。

参考文献

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[7] de Oliveira FA， Barreto AS， Bomfim LG， et al. Soluble CD40 Ligand in Sera of Subjects Exposed to Leishmania infantum Infection Reduces the Parasite Load in Macrophages. PLoS One， 2015， 10（10）：e0141265.

[收稿日期：2016-05-26]