HPLC法测定万古霉素血药浓度

崔海珍，郭义明，于　倩（吉林大学中日联谊医院药学部，吉林 长春 130033）

·实验研究·

HPLC法测定万古霉素血药浓度

崔海珍，郭义明，于倩（吉林大学中日联谊医院药学部，吉林 长春 130033）

目的：建立高效液相色谱法测定人血浆中万古霉素浓度，考察不同沉淀剂对万古霉素提取率的影响。方法：以去甲万古霉素为内标，采用Wondasil®C18-WR色谱柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm），流速1.0 mL·min-1，检测波长236 nm。采用甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.2）与乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.2）为流动相，选择其最佳配比，通过实验优化蛋白沉淀剂的浓度及体积，并考察5种沉淀剂对血浆样品提取率的影响。结果：采用甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.2）（16 ： 84）为流动相，乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）200 μL为沉淀剂时对血浆中万古霉素提取率最好。结论：本实验优化了万古霉素血药浓度测定方法，该方法提取率高、重现性好、操作简便、灵敏，适用于万古霉素血药浓度测定。

万古霉素；高效液相色谱法；血药浓度；提取率

万古霉素属于糖肽类抗菌药物，主要用于严重革兰阳性菌感染，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染（MRSA）、表皮葡萄球菌和肠球菌耐药菌引起的重症感染［1］。目前万古霉素血药浓度测定方法有酶放大免疫测定法（EMIT）、荧光偏振免疫分析法（FPIA）、液-质联用法（LC-MS/MS）和高效液相色谱法（HPLC），其中HPLC法以高效、灵敏、费用低廉得到广泛使用。蛋白沉淀剂与流动相条件是影响提取率的重要因素之一，笔者选用HPLC法考察两种因素对万古霉素提取率的影响，并建立万古霉素血药浓度测定方法学，为临床安全、合理使用万古霉素提供理论参考。

1　仪器与试药

岛津LC-16高效液相色谱仪包括SPD-16紫外检测器、色谱工作站（日本岛津公司）；Pico17高速离心机（美国Thermo公司）；WiseMix®VM-10漩涡振荡器（韩国Daihan科学公司）；BSA 124S电子分析天平（德国Sartorius公司）。

万古霉素标准品（中国食品药品检定研究院，批号130360-201302）；去甲万古霉素标准品（中国食品药品检定研究院，含量83.4%，批号130338-200303）；甲醇、乙腈为色谱纯（美国天地有限公司）；磷酸、磷酸二氢钾、高氯酸为分析纯；超纯水。

2　方法与结果

2.1色谱条件的优化

本实验初步考察了两种流动相系统对有效成分分离测定的影响。1）甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.2），等度洗脱；2）乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.2），等度洗脱。结果表明，两种流动相系统都能使万古霉素与杂质峰分开，并且随着有机相比例的增高，万古霉素的出峰时间提前。分别考察流动相9% ～ 12%乙腈及15% ～ 19%甲醇的最佳配比，结果显示甲醇比例为16%时万古霉素有较好的分离，分离度（R）为1.900，拖尾因子（T）为1.052。当乙腈比例为12%时由于出峰时间提前无法与杂质峰分开，所以减少有机相比例为9.5%时分离度（R）为1.741，拖尾因子（T）为1.058满足分析要求。最终确定甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液（16 ： 84）和乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液（9.5 ：90.5）为流动相。

2.2色谱条件

色谱柱：Wondasil®C18-WR柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.2） （16 ： 84）/乙腈- 0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.2） （9.5 ： 90.5）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：236 nm；进样量：20 μL。

2.3溶液的配制

对照品溶液：精密称取万古霉素对照品10 mg于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容为1000 μg·mL-1的储备液。将储备液依次稀释成500、250、150、100、50 μg·mL-1系列浓度，4 ℃避光保存。

内标溶液：精密称取去甲万古霉素对照品5 mg于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容为500 μg·mL-1的储备液，4 ℃避光保存。

2.4血浆样品预处理方法的优化

2.4.1蛋白沉淀剂种类的选择 选择6种蛋白沉淀剂考察沉淀蛋白的效果，结果显示10%硫酸锌溶液沉淀蛋白不完全，离心后上清液浑浊无法直接进样；10%三氯醋酸溶液空白血浆内源性物质干扰较多；10%高氯酸沉淀蛋白二氯甲烷萃取，处理血样时操作繁琐，二氯甲烷萃取离心后水层不宜吸出；10%高氯酸和乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）沉淀蛋白，离心后上清液澄清，空白血浆内源性物质干扰少。

2.4.2蛋白沉淀剂浓度、体积对提取率的影响 考察高氯酸、乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）在不同浓度、比例条件下对提取率的影响。结果显示，通过6% ～ 10%高氯酸对提取率影响的筛选，10%高氯酸的提取效果最好。进一步筛选10%高氯酸80 μL、200 μL对提取率的影响，结果发现200 μL血浆中加入10%高氯酸80 μL时，万古霉素的峰面积较大，提取率高。加大高氯酸的用量反而使峰面积减小，考虑为提取液的pH值对色谱柱的影响使柱效降低及万古霉素在酸性条件下的稳定性下降加快分解。此外，分别考察萃取液二氯甲烷与血浆样品体积比为1 ： 1与2 ： 1时对提取率的影响，实验结果显示加入等体积的萃取液可得到较高的提取回收率。乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）分别采用100 μL、200 μL体积时，发现后者对血浆样品的提取率较高。

2.4.3不同蛋白沉淀剂对提取率的影响 根据上述结果最终确定流动相1为甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.2），流动相2为乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.2）时，考察不同沉淀剂［10%高氯酸80 μL，10%高氯酸80 μL-二氯甲烷200 μL，10%三氯醋酸100 μL，乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）200 μL］对血浆样品提取率的影响，结果显示乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）作为沉淀剂对万古霉素提取率最好。见表1。

结合万古霉素血浆提取率与内标峰及杂质峰的分离情况，最后确定流动相为甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.2）（16 ： 84），血浆样品预处理沉淀剂为乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）。

表1　不同沉淀剂提取率实验结果Tab 1　The extraction rate results of the different precipitants

2.5血浆样品预处理

取空白血浆180 μL，依次加入万古霉素储备液20 μL，500 μg·mL-1去甲万古霉素20 μL，涡旋30 s，加乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）200 μL，涡旋2 min，离心（12 000 r·min-1）10 min，取上清液进样。

2.6血浆样品分析方法的验证

2.6.1方法专属性考察 按“2.5”项下方法分别制备空白血浆、万古霉素+去甲万古霉素+水、万古霉素+去甲万古霉素+空白血浆，按“2.2”项下方法进行测定。结果表明，万古霉素保留时间约为18.5 min，空白血浆中内源性成分不干扰万古霉素测定，详见图1。

图1　万古霉素色谱图A - 空白血浆，B - 万古霉素+去甲万古霉素+水，C - 万古霉素+去甲万古霉素+空白血浆；1 - 去甲万古霉素，2 - 万古霉素Fig 1　Chromatograms of vancomycinA - blank plasma， B - vancomycin + norvancomycin + water， C - vancomycin + norvancomycin + blank plasma； 1 - norvancomycin， 2 - vancomycin

2.6.2标准曲线的制备、检测限及定量限取健康人空白血浆180 μL，加入不同浓度的万古霉素标准液各20 μL，配制成浓度为5、10、15、25、50、100 μg·mL-1标准血样。按“2.5”项下方法处理血样、进样，以测得的万古霉素峰面积与内标去甲万古霉素峰面积之比（Y）对血浆药物万古霉素的浓度（X）进行线性回归，计算标准曲线方程Y = 0.21×10-1X - 0.000 7（r = 0.999 9，n = 6）。结果表明，万古霉素血药浓度在5 ～ 100 μg·mL-1范围内线性关系良好，检测限为2 μg·mL-1，定量限为5 μg·mL-1。

2.6.3回收率与精密度 制备10、25、100 μg·mL-1的低、中、高3种浓度万古霉素血浆样品各5份，按“2.5”项下方法处理血样，测定其浓度，计算日内、日间RSD值，方法回收率及绝对回收率（n = 5），详见表2。

表2　回收率及精密度实验结果. n = 5Tab 2　Results of recovery and precision. n = 5

2.6.4稳定性实验 制备10、25、100 μg·mL-1低、中、高3种浓度万古霉素血浆样品各5份，分别在室温放置4 h，反复冻融2次及冷冻（- 20 ℃）7 d、14 d、1个月的条件下，考察其稳定性，详见表3。

表3　稳定性实验结果. n = 5Tab 3　Results of stability. n = 5

3　讨论

3.1流动相选择

乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.2）（9.5 ： 90.5）时，万古霉素保留时间约为14.5 min，能与内标峰分开，峰形为尖高峰，但内标去甲万古霉素峰形较差，有严重拖尾现象，通过调整乙腈比例无法改变拖尾现象，影响测定结果。采用甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.2）为流动相，在调整甲醇比例时发现，当两者比例为16 ： 84时与内标峰分离完全，且目标物质不受内源性物质干扰，但峰形较矮，可能会降低本方法的定量限。

3.2蛋白沉淀剂选择

为了提高检测灵敏度，分别比较了5种沉淀剂沉淀蛋白的效果，结果表明乙腈-6%高氯酸（1 ： 6）沉淀效果好，提取回收率高。根据筛选结果进一步考察沉淀剂浓度、体积对提取率的影响，通过系统综合分析得出最好的提取效果，减少结果偏差及临床影响。

有文献［2］报道，比较4种沉淀剂时乙腈-6%高氯酸的沉淀效果最好、回收率较高、峰形佳，与本文结论相符合。也有报道［3］硫酸锌作为沉淀剂，但其蛋白沉淀效果和提取率不理想。有文献［4］报道采用60%高氯酸溶液15 μL作为沉淀剂，但实验中发现在一定浓度范围内高氯酸浓度与提取率呈正比，随着浓度的增高提取率升高。因此，在加入适当浓度及体积的高氯酸时，有助于万古霉素在提取过程中的稳定性和提取率，但加大高氯酸溶液浓度或体积时，万古霉素峰形变差，提取率降低。

有研究［5］表明，以LC-MS/MS法为对照，4种不同的免疫分析法测定的万古霉素血药浓度比较结果对临床影响，其中PETINIA法偏差及临床影响最小为2.4%、6.1%。根据国外289例样本的比较，通过Bland-Altman分析和Pearson相关性分析得出结论HPLC法敏感性为PETINIA法的8倍［6］。因此本文采用HPLC法，并结合万古霉素稳定性、血浆蛋白结合率的基础上，考察两种流动相溶液中5种沉淀剂对提取率的影响，通过比较得出不同沉淀剂对提取率存在很大差异，这直接关系到万古霉素血药浓度临床监测的准确性。因此，通过流动相配比及沉淀剂对提取率影响的优化，建立了简便、灵敏的检测方法，该方法沉淀效果好，提取率高，测定结果可靠，适用于万古霉素血药浓度测定。

［1］ 陈佰义，管向东，何礼贤，等.万古霉素临床应用中国专家共识（2011版）［J］.中国新药与临床杂志，2011，30（8）：561-573.

［2］ 胡伟，陈璐璐，孙成，等.液相色谱-质谱联用法测定人体血浆中万古霉素的浓度［J］.中国医院药学杂志，2016，36（8）：616-620.

［3］ 黄晓会，刘艳，张健.HPLC法测定人血清中万古霉素及去甲万古霉素浓度及临床应用［J］.中国药物应用与监测，2014，11（2）：92-94.

［4］ Jesús Valle MJ， López FG， Navarro AS. Development and validation of an HPLC method for vancomycin and its application to a pharmacokinetic study［J］. J Pharm Biomed Anal， 2008， 48（3）： 835-839.

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［6］ Usman M， Hempel G. Development and validation of an HPLC method for the determination of vancomycin in human plasma and its comparison with an immunoassay （PETINIA）［J］. Springerplus， 2016， 5： 124.

Determination of vancomycin concentration in human plasma by HPLC

CUI Hai-zhen， GUO Yi-ming， YU Qian（Department of Pharmacy， China-Japan Union Hospital of Jilin University， Changchun 130033， China）

Objective： To establish the method for determination of vancomycin in human plasma by HPLC， and investigate the effects of different precipitants to vancomycin extraction rate. Methods： Norvancomycin was used as the internal standard， the liquid chromatography was performed on Wondasil®C18-WR column （4.6 mm × 150 mm， 5 μm）， the flow rate was 1.0 mL·min-1， and UV detector wavelength was 236 nm. Using two mobile phases of methanol-0.05 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate buffer （pH 3.2） and acetonitrile-0.05 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate buffer （pH 3.2） to select the best ratio of mobile phase. The concentration and volume of protein precipitants were optimized through experiments， five kinds of precipitant were used to investigate the affect of plasma sample extraction rate. Results： The results showed that mobile phase consisted of methanol-0.05 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate buffer （pH 3.2） （16 ： 84） and acetonitrile-6% perchloric acid （1 ： 6） as a precipitant， the extraction rate was the best. Conclusion： The method for the determination of plasma vancomycin concentration was optimized and proved to be high extraction rate， reproducible， simple and sensitive， it is suitable for the determination of vancomycin concentration.

Vancomycin； HPLC； Blood drug concentration； Extraction rate

R917

A

1672 - 8157（2016）05 - 0268 - 04

于倩，女，主任药师，主要从事医院药学及药事管理工作。E-mail：819389186@qq.com

崔海珍，女，药师，主要从事医院药学工作。E-mail：289483722@qq.com

（2016-02-26

2016-04-14）