DMOG促进骨髓间充质干细胞血管新生作用的研究

朱美飞 江荣林 雷澍 王灵聪 刘骞

DMOG促进骨髓间充质干细胞血管新生作用的研究

朱美飞 江荣林 雷澍 王灵聪 刘骞

目的 探讨在缺氧缺血清环境下，脯氨酸羟化酶抑制剂——二甲基乙二酰甘氨酸（DMOG）促进骨髓间充质干细胞（MSCs）血管新生的作用及其机制。方法 MSCs从大鼠骨髓中分离得到，分为：常氧条件下溶剂对照组（N-DMSO）、缺氧条件下溶剂对照组（H-DMSO）、20μM DMOG加药组（D-20μM）、100μM DMOG加药组（D-100μM）及500μM DMOG加药组（D-500μM），观察以下指标：（1）通过缺氧条件下CCK-8检测DMOG在20μM、100μM及500μM剂量下对MSCs的保护作用，确定DMOG的最佳剂量；（2）通过Matrigel实验观察DMOG促进MSCs血管新生的作用；（3）通过Western blot法检测血管新生通路相关蛋白表达。结果 （1）不同浓度组DMOG对缺氧损伤MSCs的影响：N-DMSO组OD值3.25±0.05，H-DMSO组2.23±0.14，D-20μM组2.68±0.43，D-100μM组3.11±0.25，D-500μM组3.23±0.04。与N-DMSO组比较，H-DMSO组OD值降低（P＜0.01），与H-DMSO组比较，D-20μM组、D-100μM组、D-500μM OD值均升高（P＜0.05或0.01）。（2）不同浓度组DMOG对正常MSCs的影响：D-20μM组3.19±0.02，D-100μM组3.15±0.06，D-500μM组2.51±0.08。与N-DMSO组比较，D-500μM组OD值降低（P＜0.01），D-20μM组、D-100μM组与N-DMSO组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），提示DMOG在20μM及100μM对细胞无毒性。（3）血管新生相关蛋白的表达：与H-DMSO组相比，D-100μM组缺氧3、6及24h HIF-1α均增加（1.44±0.32 vs 7.79± 0.23，2.4±0.28 vs 3.51±0.79，0.93±0.37 vs2.46±0.07，P＜0.05或0.01），pAKT则在缺氧6h增加（0.47±0.15 vs 0.71±0.03，P＜0.05），VEGF在缺氧6、24h均增加（0.63±0.10 vs 0.87±0.14，0.42±0.06 vs 0.70±0.06，P＜0.05或0.01），以缺氧24h最为显著。pmTOR/mTOR及pERK/ERK蛋白两组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论 DMOG通过抑制HIF-1α降解及促进AKT磷酸化提高缺氧环境下MSCs的血管新生能力。

骨髓间充质干细胞 二甲基乙二酰甘氨酸 血管新生 缺氧

骨髓间充质干细胞（MSCs）是一种非造血的多功能干细胞，它具有取材方便、来源充足、定向分化、无免疫排异等优势，是目前细胞治疗心血管疾病的前沿热点。现代研究表明，MSCs具有抗心肌细胞凋亡、诱导分化为心肌细胞、促进心脏交感神经重构、修复损伤的内皮、改善心肌梗死后心室重塑、改善心功能降低梗死面积和促进血管新生等作用[1-3]。然而在缺氧环境中MSCs存活率低，且疗效不显著。二甲基乙二酰甘氨酸（DMOG）是一种脯氨酞经化酶抑制剂，能够抑制细胞内低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的降解，继而使细胞核内很多基因（如促红细胞生成素（EPO）、血管内皮生长因子（VEGF）、血管生成素1（Ang-1）和葡萄糖转运蛋白1（Glut-1）等的转录和表达增高，继而发挥保护作用。在体外的研究中发现，DMOG能够改善心肌细胞和神经元在缺血清或缺神经营养因子等恶劣环境下的生存能力[4-5]，促进MSCs动员[6]。但是，DMOG能否促进缺氧条件下MSCs的血管新生能力及其可能的机制目前鲜有报道。本实验通过研究DMOG在缺氧缺血清条件下促进MSCs血管新生的能力，对其可能的机制进行探讨，以期对MSCs移植治疗保护剂的开发提供一定的实验依据，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料 DMOG（美国Selleckchem公司）；一抗为HIF-1α（1∶1 000，英国Abcam公司）、pAKT（1∶1 000，美国CST公司）、AKT（1∶1 000，美国CST公司）、pmTOR（1∶1 000，美国CST公司）、mTOR（1∶1000，美国CST公司）、pERK（1∶1 000，美国CST公司）、ERK（1∶1 000，美国CST公司）、VEGF（1∶1 000，美国CST公司）、HRP-Actin（1∶10 000，中国康诚生物科技有限公司）；二抗为HRP标记的羊抗兔IgG抗体（1∶5 000，美国Santacruz公司）；Growth factor reduced matrigel（美国Corning公司）；CCK-8（日本Dojindo公司）；低糖DMEM（美国Invitrogen公司）、FBS（美国Gibco公司）。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分离鉴定 MSCs从6周龄大鼠的股骨和胫骨中分离得到，10%FBS低糖DMEM进行培养，并且采用流式细胞术对 CD29、CD44、CD73、CD90及CD105等分子表型进行鉴定[7]。

1.2.2 CCK-8细胞存活检测 MSCs消化后接种于96孔板，3 000个细胞/孔，设5复孔，隔天贴壁后换液（2% FBS的DMEM培养液），分别设常氧DMSO（N-DMSO组）及给药组（D-20μM组、100μM组、500μM组）、缺氧DMSO（H-DMSO）及给药组（D-20μM组、100μM组、500μM）：加入DMSO及20、100和500μM DMOG，分别放入缺氧培养箱（0.1%O2/5%CO2）及常氧培养箱孵育48h，CCK-8试剂盒检测细胞存活。

1.2.3 管腔形成实验 Matrigel每孔50μl加入96孔板，置于37℃孵育箱30min凝固后，将MSCs消化后以2%FBS的DMEM培养液重悬，5 000个细胞/孔接种入铺有Matrigel的96孔板，分别设DMSO组与100μM浓度的DMOG组（D-100），加入DMSO及100μM DMOG后放入缺氧箱，6h后观察MSCs的管腔形成作用，显微镜拍照（5×）。

1.2.4 血管新生相关蛋白表达检测 MSCs消化后接种于6孔板，2×105个细胞/孔，隔天贴壁后换液（2%FBS的DMEM培养液），加入DMSO及100μM DMOG后放入缺氧培养箱（设为H-DMSO组及D-100μM组），同时设正常对照组（N-DMSO）。分别缺氧3、6及24h后采用2.5×loading buffer收集蛋白，95℃煮30min后冰上冷却上样。SDS-PAGE电泳、转膜、封闭2h，分别加HIF-1α、pAKT、AKT、pmTOR、mTOR、pERK、ERK、VEGF、HRPActin抗体4℃孵育过夜，洗膜3次，加山羊抗兔二抗室温孵育1 h，洗膜3次，ECL显影，BioRad MP仪器曝光，用Image Lab软件进行分析。

1.3 统计学处理 采用Minitab 14统计软件，计量资料以表示，组间比较采用单因素方差（One way ANOVO）分析。

2 结果

2.1 不同浓度组DMOG对缺氧损伤MSCs的影响 N-DMSO组OD值3.25±0.05，H-DMSO组2.23±0.14，D-20μM组2.68±0.43，D-100μM组3.11±0.25，D-500μM 3.23±0.04。与N-DMSO组比较，H-DMSO组OD值降低（P＜0.01），与H-DMSO组比较，D-20μM组、D-100μM组、D-500μM OD值均升高（P＜0.05或0.01）。

2.2 不同浓度组DMOG对正常MSCs的影响 N-DMSO组OD值3.25±0.05，D-20μM组3.19±0.02，D-100μM组3.15±0.06，D-500μM 2.51±0.08。与N-DMSO组比较，D-500μM OD值降低（P＜0.01），D-20μM组、D-100μM组与N-DMSO组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。因此确定DMOG最佳浓度为100μM。

2.3 DMOG对缺氧环境下MSCs的管腔形成作用的影响 见图1。

图1 Matrigel实验测定管腔形成示意图

由图1可见，DMSO与100μM DMOG分别作用6h后，DMOG明显促进MSCs形成管腔。提示DMOG具有促进MSCs血管新生的作用。

2.4 血管新生相关蛋白的表达 见图2、表1。

图2 血管新生相关蛋白表达水平比较图

表1 血管新生相关蛋白的表达

由图2及表1可见，与H-DMSO组相比，D-100μM组缺氧3、6及24h HIF-1α均增加（P＜0.05或0.01），pAKT则在缺氧6h增加，VEGF在缺氧6、24h均增加（P＜0.05或0.01），以缺氧24h最为显著。pmTOR/mTOR及pERK/ERK蛋白两组差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

3 讨论

HIF-1是血管新生的调控者，随着细胞内氧浓度变化而调节基因表达的转录激活因子。HIF-1由调节亚单位HIF-1α及结构亚单位HIF-1β组成。在常氧条件下，细胞内HIF-1α不稳定，可通过泛素蛋白酶体降解；在低氧条件下，HIF-1α稳定性增加，转移至细胞核，与HIF-1β组成二聚体，与细胞核染色体上的顺式作用元件HRE相互作用，从而调控包括VEGF在内的多种下游基因的转录和翻译[8-9]。因此，抑制HIF-1α的降解、促进其合成及诱导VEGF基因表达，对于调控血管新生等低氧应答反应具有重要意义。HIF-1α是脯氨酸羟化酶唯一的底物。脯氨酸羟化酶抑制剂可以抑制HIF-1α的羟化，减少常氧状态下HIF-1α的降解，从而稳定HIF-1α的表达，激活HIF-1α下游信号通路[10]。DMOG为酮戊二酸类似物，通过与内源性的2-酮戊二酸竞争从而抑制脯氨酸羟化酶[11]。本研究结果发现DMOG对缺氧、缺血清损伤的MSCs具有明显的保护作用，并且能够促进缺氧环境下MSCs的血管新生作用，提示DMOG处理后可促进MSCs在心肌缺血环境存活及提高其血管新生能力。

本实验还对DMOG处理后其诱导MSCs血管新生的相关通路蛋白进行检测，结果提示一方面DMOG可能通过抑制HIF-1α的降解上调其蛋白表达促进其下游调控基因VEGF的蛋白表达，另一方面其还能通过促进AKT磷酸化激活下游血管新生相关蛋白如VEGF等的蛋白表达，这两方面的共同作用导致其血管新生作用效果显著。

综上所述，DMOG在100μM时促进缺氧环境下MSCs细胞存活及血管新生效果显著，其可能通过抑制HIF-1α的降解上调VEGF水平及促进AKT磷酸化发挥作用。

[1] Numasawa Y,Kimura T,Miyoshi S,et al.Treatment of human mesenchymal stem cells with angiotensin receptor blocker improved efficiency of cardiomyogenic transdifferentiation and improved cardiac function via angiogenesis[J].Stem Cells,2011,29 (9):1405-1414.

[2] Li Y,Hiroi Y,Ngoy S,et al.Notch1 in Bone Marrow-Derived Cells Mediates Cardiac Repair After Myocardial Infarction[J].Circulation,2011,123(8):866-876.

[3] 彭余江,李慧勇,何玺君.神经生长因子转染的人脐带间充质干细胞促进中枢神经系统损伤修复的实验研究[J].浙江医学,2015,37(3): 197-199,215.

[4] Zhang S,Ma K,Liu Y,et al.Stabilization of Hypoxia-inducible Factor by DMOG Inhibits Development of Chronic Hypoxia-Induced Right Ventricular Remodeling[J].J Cardiovasc Pharmacol, 2016,67(1):68-75.

[5] Lomb D J,Straub J A,Freeman R S.Prolyl hydroxylase inhibitors delay neuronal cell death caused by trophic factor deprivation[J]. J Neurochem,2007,103(5):1897-906.

[6] 胡韶君,余勤,刘丽珍,等.HIF-1信号通路在介导DMOG动员MSCs中的作用[J].中国比较医学杂志,2015,25(1):9-14.

[7] Chen H Q,Liu X B,Zhu W.SIRT1 ameliorates age-related senescence of mesenchymal stem cells via modulating telomere shelterin[J].Front Aging Neurosci,2014,6:103.

[8] 彭勇,陈勇,邬秀娣,等.HIF-1α及VEGF在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达及意义[J].浙江医学,2013(18):1628-1631,1643.

[9] 叶鸣,王志刚,李兴升.HIF-1α在缺血性心血管疾病中作用的研究进展[J].心脏病杂志,2010,22(5):758-759.

[10] Liu X,Tu Y,Zhang L,et al.Prolyl hydroxylase inhibitors protect from the bone loss in ovariectomy rats by increasing bone vascularity[J].CellBiochem Biophys,2014,69(1):141-149.

[11] Rahman S U,Lee MS,Baek J H,et al.The prolylhydroxylase inhibitor dimethyloxalylglycine enhances dentin sialophoshoprotein expression through VEGF-induced Runx2 stabilization[J]. PLoS One,2014,9(11):e112078.

DMOG promotes angiogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells

ZHU Meifei,JIANG Ronglin,LEI Shu,et al.Department of Critical Care Medicine,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310006,China

Objective To investigate the effect and mechanism of dimethyloxalyl glycine(DMOG)mediated on angiogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs). Methods MSCs were isolated from rat bone marrow and divided into five groups:normoxia solvent control group (N-DMSO),hypoxia solvent control group (H-DMSO),20μM DMOG treated group (D-20μM),100μM DMOG treated group(D-100μM)and 500μM DMOG treated group(D-500μM).The following indicators were observed:(1)MSCs were cultured with DMOG(20,100 and 500μM)under hypoxic condition.The growth inhibitory effect was observed by CCK-8 and the optimal dosage of DMOG was measured.(2)The angiogenic effect of MSCs was measured by Matrigel method.(3)The expression of angiogenesis related proteins were detected by Western blot. Results (1)Effect of DMOG on MSCs in different concentration groups：N-DMSO:3.25±0.05,H-DMSO:2.23±0.14,D-20μM:2.68±0.43,D-100μM: 3.11±0.25,D-500μM:3.23±0.04.As compared with N-DMSO group,H-DMSO group was significantly decreased(P＜0.01),As compared with H-DMSO group,the OD of D-20μM,D-100μM and D-500μM group were significantly increased(P＜0.05或0.01).(2)Effect of DMOG on normal MSCs in different concentration groups:D-20μM:3.19±0.02,D-100μM:3.15±0.06, D-500μM:2.51±0.08.As compared with N-DMSO group,D-500μM group was significantly decreased(P＜0.01),while D-20μM group,D-100μM group and N-DMSO group had no statistically significant difference(P＞0.05),suggesting that DMOG with 20μM and 100μM exert none cell toxicity.(3)Expression of angiogenesis related proteins:As compared with H-DMSO group, HIF-1α protein level was significantly increased in D-100μM group at 3,6 and 24h after hypoxia(1.44±0.32 vs.7.79±0.23;2.4±0.28 vs.3.51±0.79;0.93±0.37 vs.2.46±0.07,P＜0.05 or 0.01),pAKT protein level was significantly increased in D-100μM group at 6h after hypoxia(0.47±0.15 vs.0.71±0.03,P＜0.05),VEGF protein level was significantly increased in D-100μM group at 6 and 24h after hypoxia (0.63±0.10 vs.0.87±0.14;0.42±0.06 vs.0.70±0.06,P＜0.05 or 0.01),especially the 24h after hypoxia.While there was no significant difference between the two groups in protein expression of pmTOR/mTOR and pERK/ERK (P＞0.05 respectively). Conclusion DMOG inhibits the degradation of HIF-1α and promotes the phosphorylation of AKT to improve the angiogenesis of MSCs in hypoxic condition.

Bone marrow mesenchymalstem cells DMOG Angiogenesis Hypoxia

2016-04-11）

（本文编辑：马雯娜）

浙江省医药卫生一般研究计划（2013KYA142）；浙江省卫生高层次创新人才培养工程项目（2014-108）；浙江中医药大学科研基金资助（2015ZY25）

310006 杭州，浙江中医药大学附属第一医院重症医学科（朱美飞、江荣林、雷澍、王灵聪）；浙江中医药大学药学院（刘骞）

刘骞，E-mail：21019003@zju.edu.cn