丁苯酞注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及半胱氨酸蛋白酶-3表达的影响

库亚萍 周盛年

(山东大学医学院附属齐鲁医院神经内科，山东 济南 250012)

丁苯酞注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及半胱氨酸蛋白酶-3表达的影响

库亚萍1周盛年

(山东大学医学院附属齐鲁医院神经内科，山东 济南 250012)

目的 探讨丁苯酞(NBP)注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注(IR)损伤的保护作用及半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3表达的影响。方法 清洁级健康SD大鼠60只，按照随机数字表法分成假手术组(Sham组)、IR组以及NBP组各20只，另将NBP组根据NBP的用药剂量分成小剂量组(20 mg/kg)6只、中剂量组(40 mg/kg)7只、大剂量组(80 mg/kg)7只。采用Zea-longa线栓法制作大鼠局灶性IR模型，对比各组大鼠的脑梗死体积及凋亡细胞数，各组大鼠的caspase-3表达以及NBP组大鼠经不同剂量NBP处理后的caspase-3表达。结果 NBP组和IR组脑梗死体积及凋亡细胞数均明显高于Sham组，NBP组明显低于IR组(P<0.05)。NBP组和IR组皮质和海马的caspase-3阳性细胞数均明显多于Sham组，NBP组明显少于IR组(P<0.05)。中剂量及大剂量组皮质和海马的caspase-3阳性细胞数均明显少于小剂量组，大剂量组明显少于中剂量组(P<0.05)。结论 NBP对于大鼠局灶性IR损伤具有较好的保护作用，还可有效降低caspase-3的表达，值得临床重视。

丁苯酞注射液；局灶性脑缺血再灌注损伤；半胱氨酸蛋白酶-3

凋亡是造成脑缺血再灌注(IR)损伤的一个重要原因，细胞凋亡的主要机制在于脑神经细胞发生缺血缺氧现象之后，其细胞能量代谢作用出现障碍，进而生成凋亡刺激因子，并介导相关蛋白级联反应〔1〕。有研究提示半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3类型抑制剂可以作为IR损伤的一项新型治疗药物〔2〕。临床通常将丁苯酞(NBP)作为脑保护剂用于治疗IR损伤，发现其疗效较满意，该药物对脑的保护机制仍需进一步研究。本文拟分析NBP注射液对大鼠局灶性IR损伤的保护作用及caspase-3表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 选择在我院实验室所饲养的清洁级健康SD雄性8 w龄大鼠60只，体质量200～260 g，平均(235.68±15.23)g。按照随机数字表法分为假手术组(Sham组)、IR组及NBP组各20只，另将NBP组根据NBP的用药剂量分成小剂量组(20 mg/kg)6只，中剂量组(40 mg/kg)7只，大剂量组(80 mg/kg)7只。试剂与仪器：一抗：兔抗caspase-3多克隆抗体(英国Abcam公司，批号：ab2302)。二抗及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司；TTC试剂购于美国的Sigma公司；TUNEL试剂盒购于德国的罗氏公司；石蜡切片机和光学显微镜购于日本的Olympus公司；荧光定量PCR仪选择德国生产的Rotor-Gene 3000型。

1.2 方法

1.2.1 制作动物模型 IR组及NBP(石药集团恩必普药业有限公司生产，生产批号：050302)组的大鼠予以10%的水合氯醛行腹腔注射，待其麻醉之后按Zea-longa线栓法〔3〕的步骤制作大鼠右侧脑部中动脉的局灶性IR模型。而Sham组只分离大鼠的右侧颈总、颈外及颈内动脉，无需插入线栓。IR组及NBP组在缺血2 h后移除线栓而后再灌注约24 h。NBP组中的高、中、低剂量亚组在缺血2 h并拔线之后立刻予以80 mg/kg、40 mg/kg、20 mg/kg的NBP注射液行1次腹腔注射，IR组和Sham组可注射等量的生理盐水，上述步骤的实验过程均需满足动物伦理学的规范。

1.2.2 脑梗死体积的检测 每组大鼠麻醉后断头取脑，并在-20℃的冰箱内速冻约15 min，而后行2 mm厚冠状位切片共5片，放置在2%的(TTC)溶液内，于37℃的恒温箱孵育约30 min，利用4%的多聚甲醛进行固定，最后用数码相机拍照并通过图像分析软件对脑梗死体积的百分比进行计算。其中脑梗死体积的百分比=右侧脑梗死的面积×切片的厚度/右侧脑组织的总体积×100%。

1.2.3 凋亡细胞数的检测 利用TUNEL法进行检测，麻醉后将大鼠开胸并暴露心脏，自心尖插进粗针头，而后剪开右心耳使其开放静脉血，利用生理盐水迅速进行心脏灌流，待右心耳有清液流出之后利用4%的多聚甲醛行灌流固定，之后快速断头取脑，利用4%的多聚甲醛给予24 h固定。在视交叉后约2 mm位置切取3 mm冠状位脑部组织块，进行常规包埋，而后切取4 μm厚的脑片。将石蜡切片脱蜡至水，用3%的过氧化氢溶液封闭约10 min，在复合消化酶液及37℃的条件下消化约20 min，再滴入TUNEL混合液，放于37℃下1 h静置。滴入过氧化物酶(POD)转化液，在37℃下反应约40 min，经DAB显色和苏木精复染后以中性树胶封片。其中TUNEL阳性细胞的判定：细胞核有固缩浓染，且呈深棕色，相关细胞体积变小，形状不规则。将每张切片放在高倍显微镜下选择5个视野，对阳性细胞进行计数，最后取平均值。

1.2.4 caspase-3表达的检测 制备石蜡切片后实施caspase-3的免疫组化染色，利用SP法进行检测。一抗是兔抗caspase-3的多克隆抗体(产自英国的Abcam公司)，二抗及DAB显色剂产自福州的迈新生物公司。在染色后位于细胞质(核)内的棕黄色颗粒即为caspase-3阳性表达的细胞，将每张切片放置在400倍的显微镜下，分别在右侧大脑半球的缺血半暗带区的皮质及海马区随机选择10个视野，对阳性细胞进行计数，而后去平均值。

1.3 观察指标 对比各组大鼠的脑梗死体积及凋亡细胞数，各组大鼠的caspase-3表达及NBP组大鼠经不同剂量NBP处理后的caspase-3表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS21.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠脑梗死体积及凋亡细胞数比较 NBP组和IR组的脑梗死体积〔(30.48±10.11)%、(40.17±12.89)%〕及凋亡细胞数〔(29.26±2.38)个/HP，(46.69±2.95)个/HP〕均明显高于Sham组(P<0.05)，NBP组均明显低于IR组(P<0.05)。

2.2 各组大鼠caspase-3表达对比 NBP组和IR组皮质(7.55±2.51，11.78±4.02)和海马(31.18±5.82，42.73±9.20)的caspase-3阳性细胞数均明显多于Sham组(1.53±1.15，3.56±1.53)(P<0.05)，NBP组均明显少于IR组(P<0.05)。

2.3 经不同剂量NBP处理后的caspase-3表达 中剂量及大剂量组皮质(7.69±1.15，4.38±2.46)和海马(30.65±2.33，28.20±1.68)的caspase-3阳性细胞数均明显少于小剂量组(9.48±1.12，33.49±1.39)，大剂量组明显少于中剂量组(P<0.05)。

3 讨 论

通过不断开展有关缺血性脑血管类疾病发病机制以及治疗方法方面的研究，该病临床治疗方面进展较快，认为需针对脑部受损血管以及细胞两方面机制进行联合治疗，其中溶栓治疗就是对于血管损伤的一项针对性疗法〔4〕。而IR损伤为缺血性脑血管类疾病的一项重要病理生理性阶段，IR损伤发病原因十分复杂，其会以氧化应激以及炎症反应和细胞凋亡等形式对神经细胞造成损伤甚至死亡，发病机制主要分为自由基受损和细胞凋亡以及钙超载等多种学说。经过多项脑缺血式动物模型实验研究发现，可以通过形态学、生化以及基因学等多个维度进行证实，在IR损伤过程中的各重要阶段均伴有细胞凋亡现象〔5〕。因此，对IR损伤进行有效抑制是缺血性脑血管类疾病临床治疗的关键，同时，保护脑部神经系统，防止细胞凋亡是该类治疗的重点所在。

本研究符合赵秀芹等〔6〕的报道结果，提示有IR损伤的大鼠脑梗死体积和凋亡细胞数均更多，而经过NBP处理后均明显减少。笔者认为原因主要可能与NBP的脑保护作用有关。NBP注射液的活性成分为NBP，是从芹菜籽内所提取发现，通过人工合成而得的消旋类化合物，其结构与天然芹菜籽内的左旋芹菜甲素一致。临床研究发现，NBP对缺血性脑卒中起到修复中枢损伤效果，有助于改善患者受损神经，通常将其用于治疗因急性缺血性脑卒中而发生的神经功能受损〔7〕。同时，多项动物药效学相关研究均证实，NBP能够对缺血性脑卒中造成的脑损伤多项病理阶段起到有效阻断作用，并可以抑制脑缺血，减小大鼠发生缺血性脑梗死总面积，降低脑水肿程度，且对脑能量代谢以及脑血血区域内的微循环和血流动力学情况产生改善作用〔8〕。此外，该药物还可以起到保护脑神经，防止其因IR而受损的效果。其对IR受损脑神经系统的保护及修复，主要是以对细胞凋亡通路进行干扰的方式来完成。通过抑制细胞凋亡类调控基因正常表达，来获得抑制神经细胞发生凋亡作用的效果。同时，本文符合王鹏等〔9〕的报道结果，提示caspase-3参与到了大鼠的IR损伤过程中，且caspase-3阳性细胞数越少，则IR损伤的病情越轻。原因主要与caspase-3的凋亡调控路径有关。细胞凋亡在IR损伤多个环节均有参与，并且是脑神经功能受损的根本原因。因此，抑制脑神经细胞大量凋亡是治疗IR损伤的关键。其凋亡根本分子机制为，脑神经细胞发生缺血以及缺氧，进而出现能量代谢障碍，生成多种凋亡刺激类因子，例如自由基以及一氧化氮等。在上述刺激因子共同作用之下，和凋亡有关的基因会介导发生蛋白级联反应。目前已经证实，caspase依赖途径为非常关键的一种凋亡路径，其中caspase-3为该级联中最重要的一种凋亡蛋白酶〔10〕。同时，caspase-3除了为细胞凋亡过程中发生级联反应一项必经之路外，还是凋亡的一个关键酶以及执行者。因此，caspase-3在整个IR损伤中发生神经细胞凋亡情况的关键，临床使用caspase-3相关抑制剂治疗，可作为新的治疗方向。

本文还提示随着NBP用药剂量的增大，大鼠caspase-3阳性细胞数的表达也明显减少。原因主要是因为NBP的应用明显改善了大鼠的脑损伤，进而抑制了caspase-3的阳性表达。事实上，大鼠在发生IR损伤之后，NBP可有效抑制其梗死灶附近缺血半暗带区域内神经元中caspase-3的表达，进而阻止神经元发生凋亡，获得保护神经结构和功能的效果；与Nong等〔11〕的报道相似。

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2 纪海茹,孔令伟,孔 维,等.丁苯酞对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障的影响〔J〕.中华老年心脑血管病杂志,2015;17(3):307-9.

3 李国前,王杰华,许秀秀,等.瑞舒伐他汀对脑缺血再灌注大鼠白细胞介素-23/白细胞介素-17炎症轴的影响〔J〕.中国临床药理学杂志,2016;32(10):894-6.

4 白艳娟.丁苯酞注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠Bcl-2和Bax蛋白表达的影响〔J〕.辽宁医学院学报,2016;37(4):10-2,20.

5 赵秀芹,邓春颖,李世英,等.丁苯酞注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用〔J〕.山东大学学报(医学版),2016;54(4):25-31.

6 赵秀芹,毛文静,李世英,等.丁苯酞对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马CA1区神经细胞凋亡、SIRT1及PGC-1α表达的影响〔J〕.中国动脉硬化杂志,2016;24(8):774-80.

7 赵红如,杜 娟,蔡秀英,等.丁苯酞动员内皮祖细胞治疗脑缺血再灌注大鼠实验研究〔J〕.中华老年心脑血管病杂志,2015;17(2):193-6.

8 赵秀芹,毛文静,李世英,等.丁苯酞注射液对局灶性脑缺血再灌注大鼠的脑保护作用及机制〔J〕.中国康复理论与实践,2016;22(1):32-7.

9 王 鹏,刘华坤,张 磊,等.丁苯酞腹腔注射对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的预防作用及其机制探讨〔J〕.山东医药,2016;56(15):38-40.

10 Burgess JT,Bolderson E,Adams MN,etal.Activation and cleavage of SASH1 by caspase-3 mediates an apoptotic response〔J〕.Cell Death Dis,2016;7(11):e2469.

11 Nong K,Wang W,Niu X,etal.Hepatoprotective effect of exosomes from human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stromal cells against hepatic ischemia-reperfusion injury in rats〔J〕.Cytotherapy,2016;18(12):1548-59.

〔2016-12-28修回〕

(编辑 袁左鸣)

周盛年(1958-)，男，博士，主任医师，主要从事神经内科、脑血管病的研究。

库亚萍(1983-)，女，主治医师，主要从事神经病学、脑血管病研究。

R743

A

1005-9202(2017)05-1087-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.021

1 临沂市人民医院神经内科