黄芩苷对A549肺腺癌细胞增殖的抑制作用及机制

龙 进

(广西医科大学附属肿瘤医院药剂科，广西 南宁 530000)

黄芩苷对A549肺腺癌细胞增殖的抑制作用及机制

龙 进

(广西医科大学附属肿瘤医院药剂科，广西 南宁 530000)

目的 探讨黄芩苷对A549肺腺癌细胞株增殖的抑制作用及其相关机制。方法 将浓度为0、25、50、100、200、400 μmol/L的黄芩苷作用于经体外培养的A549人肺腺癌细胞株24、48、72 h，采用噻唑蓝(MTT)法检测黄芩苷对A549肺腺癌细胞的抑制率；收集30 μmol/L黄芩苷孵育24 h后的A549肺腺癌细胞，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定细胞周期蛋白(Cyclin)D1、增殖细胞核抗原(PCNA)及 p21 mRNA的表达水平，采用Western印迹法检测CyclinD1、PCNA及p21蛋白的表达水平。结果 不同浓度的黄芩苷对A549肺腺癌细胞的增殖均具有不同程度的抑制作用，并且呈剂量效应、时间效应关系。30 μmol/L黄芩苷(实验组)作用于A459肺腺癌细胞24 h后，CyclinD1、PCNA及其蛋白表达水平低于对照组，p21及其蛋白表达水平高于对照组(P<0.05)。结论 通过抑制CyclinD1、PCNA的表达以及促进p21的表达，黄芩苷抑制A549肺腺癌细胞增殖。

黄芩苷；A549肺腺癌细胞；增殖；抑制

肺腺癌是肺癌常见的病理类型，具有易发生远处转移，对放射治疗反应不佳以及对化疗药物存在明显的局限性等特点〔1〕。黄芩苷是从唇形科植物黄芩中提取分离得到的具有抗氧化、诱导干细胞分化等多种药理作用的黄酮类化合物〔2〕。报道显示，黄芩苷具有抑制肿瘤细胞增殖和促进凋亡等作用〔3〕，目前对黄芩苷的抗肿瘤机制的研究主要集中在肝细胞癌、膀胱癌以及结肠癌等恶性肿瘤〔4～6〕。关于黄芩苷对肺腺癌细胞增殖抑制的研究相对较少，本研究旨在探讨黄芩苷对A549肺腺癌细胞增殖的抑制作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 A549肺腺癌细胞株(由中国科学院上海细胞研究所提供)，纯度为99.1%的黄芩苷(南京青泽医药公司提供)，RPMI1640培养基、胎牛血清及胰蛋白酶(美国Gibco公司提供)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、增殖细胞核抗原(PCNA)、p21等相关的一抗(美国Santa Cruz公司提供)，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(大连宝生物技术公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将A549肺腺癌细胞株培养在内含10%胎牛血清、100 mg/L链霉素、100 U/ml青霉素的RPMI1640培养基中，2～3 d更换1次培养液，收集对数生长期的细胞准备实验。

1.2.2 噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制率 采用0.25%的胰蛋白酶消化对数生长期的A549肺腺癌细胞，将其细胞密度调整为1×107/L，然后接种到96孔板内，将浓度分别为0、25、50、100、200、400 μmol/L的黄芩苷加入其中孵育24、48、72 h，在培养终止前每孔加入终质量浓度为0.5 g/L的MTT继续孵育4 h，弃去上清液，将100 μl的二甲基亚砜加入其中振荡以充分溶解，采用酶标仪测定波长为490 nm时的吸光度(A)值并计算细胞的生长抑制率。生长抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%，其中实验组为30 μmol/L的黄芩苷，对照组为0 μmol/L的黄芩苷。每组6个复孔，实验重复3次，计算10%细胞生长抑制时的药物浓度(IC10)和50%细胞生长抑制时的药物浓度(IC50)半数抑制浓度。

1.2.3 RT-PCR法测定CyclinD1、PCNA及p21 mRNA表达情况 将浓度为30 μmol/L的黄芩苷加入到A549肺腺癌细胞中孵育24 h，收集细胞并提取细胞中的RNA，在95℃下5 min预变性，95℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 30 s，25个循环后72℃延伸10 min，严格按照RT-PCR试剂盒上的说明实施反转录以及目的片段的扩增。采用1%的琼脂糖凝胶电泳对RT-PCR的扩增产物进行分离并扫描成像，采用凝胶成像分析系统对其进行分析。以未做任何处理的A549肺腺癌细胞株为对照组，GAPDH为内参照。以下为引物的序列：CyclinD1的上游引物序列为，下游引物序列为，扩增的产物是386 bp；PCNA的上游引物序列为，下游引物序列为，扩增的产物是369 bp；p21的上游引物序列为，下游引物序列为，扩增的产物是427 bp；内参照GAPDH的上游引物序列为，下游引物序列为，扩增的产物是452 bp。

1.2.4 Western印迹法测定CyclinD1、PCNA及p21蛋白表达情况 采用Bradford法测定实验组和对照组细胞总蛋白的浓度，再分别采集40 μg各例蛋白样本以10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，将其转移到聚偏氟乙烯膜用5%的脱脂奶粉在室温环境下封闭60 min，将1∶400稀释过的一抗加入其中，在4℃环境下孵育24 h，将二抗加入其中孵育90 min后漂洗，以化学发光法进行显色，内参照为GAPDH。BioRad图像分析系统对蛋白条带的A值进行测定，目的蛋白的相对表达水平=目的蛋白A值/内参照蛋白蛋白A值，实验重复3次取平均值。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 黄芩苷对A549肺腺癌细胞增殖的抑制作用 不同浓度黄芩苷对A549肺腺癌细胞的增殖均具有不同程度的抑制作用，并且呈剂量效应、时间效应关系(见图1)；黄芩苷作用于A549肺腺癌细胞24、48、72 h的IC10分别为31、26、23 μmol/L。IC50分别为225、183、126 μmol/L，细胞抑制率≤10%是黄芩苷的非细胞毒性浓度，本研究选择30 μmol/L作用时间24 h为实验室的安全剂量。

2.2 黄芩苷对A549肺腺癌细胞CyclinD1、PCNA及p21 mRNA表达的影响 实验组CyclinD1、PCNA的表达水平低于对照组，p21的表达水平高于对照组(P<0.05)。见表1。

2.3 两组A549肺腺癌细胞CyclinD1、PCNA及p21蛋白水平比较 实验组CyclinD1蛋白、PCNA蛋白水平低于对照组，p21蛋白水平高于对照组(P<0.05)。见表2。

图1 黄芩苷对A549肺腺癌细胞增殖的抑制作用表1 黄芩苷对A549肺腺癌细胞CyclinD1、PCNA及 p21 mRNA表达的影响

表2 比较两组A549肺腺癌细胞CyclinD1、PCNA及 p21蛋白水平

3 讨 论

目前临床主要采取放化疗治疗肺腺癌，以提高恶性肿瘤患者的生活质量和延长生存时间，但报道显示，化疗药物对患者存在不同程度的不良反应〔7〕。从天然植物中提取、分离抗肿瘤药物成为目前抗肿瘤新药研发的热点，《神农本草经》载有黄芩具有泻火解毒、清热燥湿以及止血等功效，而现代药理学研究表明黄芩有抗病毒、抗过敏、抗氧化以及抗肿瘤的作用〔8〕。黄芩苷是从中药黄芩中提取、分离而来的黄酮类化合物，它可有效抑制肿瘤细胞的增殖、促进细胞的凋亡以及抗新生血管生成〔9,10〕。本研究结果提示黄芩苷具有明显的抗肺腺癌效果，与有关研究结果一致〔11〕。肺腺癌的发病机制主要与肿瘤的细胞周期出现紊乱进而导致细胞过度的增殖、生长有关，CyclinD1通过与细胞周期蛋白激酶(CDK)4结合而启动DNA的复制，以使细胞从G1期进入到S期来参与细胞周期的过程〔12〕，PCNA作为DNA聚合酶的附属蛋白，可以反映细胞增殖率以及DNA的合成率，其水平越高，提示细胞增殖效果越强〔13〕，p21蛋白属于细胞周期抑制蛋白，具有最广泛的激酶抑制活性，它通过使Cyclin-CDK复合物的激酶活性丧失而参与肿瘤细胞的增值过程〔14〕。本研究结果说明黄芩苷通过下调CyclinD1、PCNA，上调p21水平而在抑制A549肺腺癌细胞增殖方面发挥作用，推测可能是因为黄芩苷通过多个途径，如促进肿瘤细胞的凋亡、抑制新生血管的生成等达到抗肿瘤的目的〔15〕。

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2 韦小白,董竞成.黄芩苷对人肺腺癌LTEP-A2细胞的抑制作用及机制研究〔J〕.世界中医药,2014;9(2):213-7.

3 Wang XF,Zhou QM,Du J,etal.Baicalin suppresses migration,invasion and metastasis of breast cancer via p38MAPK signaling pathway〔J〕.Anticancer Agents Med Chem,2013;13(6):923-31.

4 Yin H,Bhattarai JP,Oh SM,etal.Baicalin activates glycine and〔Formula:see text〕-aminobutyric acid receptors on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subsnucleus caudalis in juvenile mice〔J〕.Am J Chin Med,2016;44(2):389-400.

5 Lin C,Tsai SC,Tseng MT,etal.AKT serine/threonine protein kinase modulates baicalin-triggered autophagy in human bladder cancer T24 cells〔J〕.Int J Oncol,2013;42(3):993-1000.

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7 张 鹏,李晓冰,任虎虎,等.经皮肝动脉栓塞化疗联合洛铂热灌注化疗治疗不能手术切除的肝细胞癌的近期疗效观察〔J〕.中国肿瘤临床,2013;40(5):284-6.

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14 Wang H,Zhu LJ,Yang YC,etal.MiR-224 promotes the chemoresistance of human lung adenocarcinoma cells to cisplatin via regulating G1/S transition and apoptosis by targeting p21(WAF1/CIP1)〔J〕.Br J Cancer,2014;111(2):339-54.

15 Yu Y,Pei M,Li L.Baicalin induces apoptosis in hepatic cancer cells in vitro and suppresses tumor growth in vivo〔J〕.Int J Clin Exp Med,2015;8(6):8958-67.

〔2016-06-16修回〕

(编辑 滕欣航)

龙 进(1964-)，男，硕士，副主任药师，主要从事中草药鉴定、分离、含测及医院药学的研究。

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A

1005-9202(2017)05-1094-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.024