P-选择素、溶酶体颗粒糖蛋白、血小板活化因子和血浆D-二聚体水平与下肢深静脉血栓形成的关系

张蕴鑫 刘建龙 贾 伟 田 轩 蒋 鹏 程志远

(北京积水潭医院血管外科，北京 100035)

P-选择素、溶酶体颗粒糖蛋白、血小板活化因子和血浆D-二聚体水平与下肢深静脉血栓形成的关系

张蕴鑫 刘建龙 贾 伟 田 轩 蒋 鹏 程志远

(北京积水潭医院血管外科，北京 100035)

目的 探讨血小板表面P-选择素(CD62P)、溶酶体颗粒糖蛋白(CD63)、血小板活化因子(PAF)、血浆D-二聚体(D-D)与下肢深静脉血栓形成的关系。方法 171例下肢深静脉血栓形成患者为病例组，并给予常规治疗，采用流式细胞仪检测治疗前、治疗后7 d的血浆CD62P和CD63的阳性率，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定治疗前、治疗后7 d血清PAF和血浆D-D水平，分析CD62P、CD63、PAF、D-D与双下肢周径差的关系，并与同期随机选取60例无血管相关疾病的对照组患者进行比较。结果 病例组治疗前CD62P、CD63阳性率及PAF、D-D水平高于对照组(P<0.05)；治疗后均降低，且仍高于对照组(P<0.05)。与治疗前相比，病例组治疗后7 d膝上15 cm、膝下10 cm患肢与健肢周径差均降低(P<0.05)。经Pearson积矩相关分析，病例组治疗前CD62P、CD63、PAF、D-D与膝上15 cm、膝下10 cm患肢与健肢周径差均呈正相关关系(P<0.05)。结论 CD62P、CD63、PAF和血浆D-D与下肢深静脉血栓形成有密切关系，联合检测可作为早期诊断和早期预测下肢深静脉血栓形成的重要指标。

下肢深静脉血栓；血小板表面P选择素；溶酶体颗粒糖蛋白；血小板活化因子；血浆D-二聚体

下肢深静脉血栓形成的过程中，血小板的活化、血管内皮细胞的损伤在血栓的形成过程中有重要作用。P-选择素(CD62P)在静止血小板的α颗粒及活化的血小板质膜上的膜糖蛋白颗粒均有表达，是评估血小板活化的“金标准”〔1〕，溶酶体颗粒糖蛋白(CD63)、D-二聚体(D-D)是反映凝血和纤溶系统成分的指标，当血液处于高凝状态时血小板功能增强，此时体内血液凝固性增强，同时存在继发性纤溶性亢进，CD63和D-D水平升高〔2〕，血小板活化因子(PAF)通过促进血小板的聚集而诱导血栓的形成，是反映血小板形成的标志物〔3〕。本研究旨在探讨CD62P、CD63阳性率以及血清PAF和血浆D-D水平与下肢深静脉血栓形成的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2015年9月至2016年8月我院收治的171例下肢深静脉血栓形成患者为病例组，纳入标准：①所有患者均符合2012年中国中西医结合研究会周围血管病专业委员会制定的诊断标准〔4〕；②入院前未接受过抗凝等药物治疗者；③入院前未服用过可能影响血液成分的药物；④近2 w内未发生过活动性出血。排除标准：①妊娠期及哺乳期妇女；②心脏功能不全者；③肝、肾功能障碍者；④自身免疫性疾病等炎症反应性疾病者；⑤合并有其他慢性疾病如高血压、糖尿病者；⑥恶性肿瘤者。其中男95例，女76例；年龄44～75〔平均(53.67±7.82)〕岁。于同期随机选取60例无血管相关疾病的住院患者为对照组，纳入标准：①所有患者未服用过可能影响血液成分的药物；②既往无静脉血栓病史及其他血液系统疾病；③无凝血功能障碍者；④无心、肝、肾功能不全者；⑤无外周血管病及脑血管病者；⑥无其他可能影响本研究结果的疾病如急、慢性感染等。其中男34例，女26例；年龄38～76〔平均(51.08±8.91)〕岁。两组性别构成比、年龄比较无统计学差异(P>0.05)，存在可比性。

1.2 方法

1.2.1 仪器及试剂 贝克曼-ELITE-ESP型流式细胞仪、2%多聚甲醛、D-D试剂盒(上海瑞齐生物科技有限公司)。藻红蛋白标志物的抗CD62P、CD63-PE、美国RB Human PAF ELISA(血清)试剂盒，同型对照羊抗体LgG1-PE(美国BD公司)，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗CD61抗体(CD61-FITC)。

1.2.2 标本采集 病例组患者入院后给予常规治疗，并于治疗前、治疗后7 d清晨空腹收集肘静脉血6 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，对照组在入院后清晨抽取空腹静脉血6 ml于抗凝管，并且监测患者髌骨上15 cm和髌骨下10 cm处的周径进行测量，计算周径差。

1.2.3 测定方法 ①将其中2 ml经EDTA抗凝处理的血液标本1 200 r/min离心5 min，并留取含血小板的血浆，同时保留血清置于-70℃环境下保存，留待检测PAF。取3只分别加入10 μl 的CD61-FITC试管，然后分别加入10 μl的 LgG1-PE、CD62P-PE、CD63-PE，再在3只试管中加入抗凝全血10 μl富含血小板的血浆以及80 μl的磷酸盐缓冲液(PBS)液，在室温环境中避光孵育30 min，再加入含2%多聚甲醛的PBS 500 μl。通过阴性对照管调整电压后检测测定管，测到CD62P-PE、CD63-PE，以CD62设门分析CD61门中CD62P、CD63的阳性率，同时分析活化的血小板，CD62P阳性率=(CD61门中标记上CD62P血小板/CD61门中全部血小板)×100%，CD63阳性率=(CD61门中标记上CD63血小板/CD61门中全部血小板)×100%。②同时取2 ml经EDTA抗凝处理的血液标本采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定D-D水平，严格按照试剂盒上的说明进行相关操作。③取2 ml经EDTA抗凝处理的血液标本经1 200 r/min离心5 min，留取上清液检测PAF水平，ELISA法检测。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行t检验、χ2检验和Pearson积矩相关分析。

2 结 果

2.1 两组患者CD62P、CD63阳性率及PAF、D-D水平比较 病例组治疗前CD62P、CD63阳性率及PAF、D-D水平高于对照组(P<0.05)，治疗后7 d均低于治疗前且高于对照组(P<0.05)，各组间差异均有统计学意义。见表1。

2.2 病例组患者治疗前后患肢与健肢周径差比较 病例组患者治疗后7 d膝上15 cm、膝下10 cm患肢与健肢周径差〔(2.35±0.46)cm、(2.04±0.55)cm〕均小于治疗前〔(4.87±0.58)cm、(3.29±0.61)cm;t=44.526、19.902,均P=0.000〕。各组间差异均有统计学意义。

2.3 病例组治疗前CD62P、CD63、PAF、D-D与双下肢周径差的相关性 病例组患者治疗前CD62P、CD63、PAF、D-D与膝上15 cm患肢、膝下10 cm患肢和健肢周径差均呈正相关(r=0.379、0.426、0.418、0.382；r=0.361、0.398、0.402、0.385，均P<0.05)。

表1 两组CD62P、CD63阳性率及PAF、D-D水平比较

与对照组比较：1)P<0.05；与病例组治疗前比较：2)P<0.05

3 讨 论

下肢深静脉血栓形成约占周围血管性疾病的60%，如果在急性期阶段不能及时诊断并给予有效的治疗，可引起静脉血栓后遗症以及致命性肺栓塞〔5〕。超声是下肢深静脉血栓的主要诊断手段，具有灵敏度高、特异性高的特点，诊断符合率可高达97%，但是，多普勒超声虽然能诊断下肢深静脉血栓形成，但是无法确定血栓情况下机体是否处在纤溶状态，因此不能预测下肢深静脉血栓形成。正常情况下血小板处于静息状态，当受到病理性的刺激时，血小板活化，在血栓形成过程中，血小板的活化具有重要意义，是血栓前状态的重要指标〔6〕。在血小板活化过程中随着活化血小板的脱颗粒，静息血小板胞质内α颗粒膜上的糖蛋白CD62P和溶酶体膜上的CD63与血小板膜融合进行标记〔7〕。CD62P主要存在于静息状态下血小板的α颗粒膜上，是反映血小板活化的重要标志物，当血小板出现活化反应时，通过开放的管道系统，血小板内的α颗粒与质膜融合，从而使血小板质膜上的CD62P分子表达量增加〔8〕，CD63作为结构较为独特的糖蛋白〔4〕。PAF在血小板-中性粒细胞的活化过程中有重要作用，是目前发现最强的炎症因子和血小板聚集诱导剂。PAF与CD62P具有协同效应，两者在内皮细胞的表面表达而介导白细胞与血管内皮细胞黏附，同时PAF通过活化白细胞而促进整合素的表达，进而形成稳定的黏附。D-D诊断血栓性疾病具有重要的价值，是反映机体内血液高凝以及纤溶亢进的指标〔9〕。

本研究结果说明下肢深静脉血栓形成患者体内血小板活化反应较明显，血小板活化参与了血栓的形成及发展过程，该结果可在一定程度说明CD62P、CD63、PAF、D-D作为下肢深静脉血栓形成的早期诊断和早期预测指标具有重要意义。另外常规的抗凝、溶栓、抗血小板治疗能有效改善患者的病情，降低血小板活化程度。研究还提示通过治疗患者仍然存在不同程度的血小板活化，因此对于接受治疗的下肢深静脉血栓形成患者，应考虑增加治疗药物的剂量，治疗结束后仍需要定期随访。此外，经治疗后，患者的血栓有一定程度的改善。而且CD62P、CD63、PAF、D-D与双下肢周径差的变化情况一致，因此推断上述指标可作为早期诊断和早期预测下肢深静脉血栓形成的重要指标。

1 张纪媛，郭丹青，何 惠.下肢深静脉血栓患者外周血血小板p-选择素、D-二聚体及超敏C反应蛋白的表达及临床意义〔J〕.中国医药导报，2014；11(20)：34-6.

2 边树疆，朱 兵，田广磊，等.血浆D-二聚体检测在下肢深静脉血栓诊断中的价值〔J〕.现代生物医学进展，2011；11(19)：3764-6.

3 Vadas P.The platelet-activating factor pathway in food allergy and anaphylaxis〔J〕.Ann Allergy Asthma Immunol，2016；117(5)：455-7.

4 中国中西医结合学会周围血管病专业委员会.中国中西医结合学会周围血管病专业委员会2012学术年会在上海召开〔J〕.中国中西医结合杂志，2012；32(12)：1646.

5 Min SK，Kim YH，Joh JH，etal.Diagnosis and treatment of lower extremity deep vein thrombosis：korean practice guidelines〔J〕.Vasc Specialist Int，2016；32(3)：77-104.

6 Barrett TW，Wrenn KD，Slovis CM，etal.An outpatient management protocol for emergency department patients with a newly diagnosed lower extremity deep venous thrombosis〔J〕.Crit Pathw Cardiol，2016；15(3)：75-6.

7 Vandy FC，Stabler C，Eliassen AM，etal.Soluble P-selectin for the diagnosis of lower extremity deep venous thrombosis〔J〕.J Vasc Surg Venous Lymphat Disord，2013；1(2)：117-25.

8 芦 璐，房淑欣，胡浩然.D-dimer、P-selection、ACA与下肢深静脉血栓形成和复发的研究〔J〕.中华全科医学，2013；11(10)：1504-5，1518.

9 Matsuo H，Nakajima Y，Ogawa T，etal.Evaluation of D-Dimer in Screening Deep Vein Thrombosis in Hospitalized Japanese Patients with Acute Medical Diseases/Episodes〔J〕.Ann Vasc Dis，2016；9(3)：193-200.

〔2016-06-27修回〕

(编辑 滕欣航)

刘建龙(1966-)，男，主任医师，主要从事外周血管疾病研究。

张蕴鑫(1987-)，男，博士，医师，主要从事外周血管疾病研究。

R6

A

1005-9202(2017)05-1221-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.086