赞比亚蜜中多酚类化合物的研究

赵宏玉，张根生，张红城

（1.哈尔滨商业大学，黑龙江哈尔滨150010；2.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093）

赞比亚蜜中多酚类化合物的研究

赵宏玉1，2，张根生1，*张红城1，2

（1.哈尔滨商业大学，黑龙江哈尔滨150010；2.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093）

赞比亚蜜是赞比亚特有的珍贵蜂蜜，具有比其他蜂蜜品种更为明显的降血压效果。利用固相萃取-高效液相色谱法结合LC-MS/MS研究赞比亚蜜样品中多酚类化合物成分及含量，结果表明，赞比亚蜜中含有脱落酸，芥子酸、柯因、短叶松素-3-乙酸酯、山奈酚及p-香豆酸。其中，以柯因的含量最高，为51.44 μg/100 g，脱落酸次之。

赞比亚蜜；多酚类成分；高效液相色谱法；液相-二级质谱联用

0 引言

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜或者其他生长部位的分泌物，与自身特定物质结合，并经由沉积、脱水、储存和离开蜂巢后成熟所形成的天然甜味物质[1]。新鲜蜂蜜为透明或半透明状液体，有较浓郁的香味，低温放置一段时间后，部分蜂蜜会变为结晶体。不同品种的蜂蜜，色泽也有所不同，从水白色到深琥珀色共分为7个等级[2]。人们不仅把蜂蜜用于食品，也将其作为一种常用中药。中医认为蜂蜜性味甘、平，具有滋补润肺、润肠、通便的功效。《神农本草经》将蜂蜜列为上品[3]。

近年来，蜂蜜作为保健食品在世界范围内被广泛应用。赞比亚是非洲中南部内陆国家，有世界著名的维多利亚瀑布、莫西奥图尼亚瀑布、卡里巴湖等，自然资源十分丰富[4]。当地的居民传承的“移养法”养蜂采蜜技术已有500多年历史。赞比亚蜜是赞比亚特有的珍贵蜂蜜，具有独特的厚重醇香味，颜色呈深咖啡色，被誉为“天然黑金”。赞比亚的花蜜来源为睦朋得树，该树的花朵具有平衡血糖、血压、血脂等功效[5]；树皮可做药材，用于治疗胃病、腹泻等；果实呈金黄色，微甜，具有独特的营养价值和药用价值[6]。

多酚类成分广泛存在于自然界中。经研究发现，多酚类物质具有较好的药理活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等[7-9]。来源于天然植物中的多酚类物质成为近年来的热点问题，有大量的研究已经对蜂蜜中的多酚类物质进行报道。而对于独特的赞比亚蜜的研究却仍处于起步阶段，赞比亚蜜中的多酚类物质尚不明确。采用固相萃取-高效液相色谱法结合LC-MS/MS研究赞比亚蜜中多酚类化合物成分及含量，旨在为其保健功能的开发提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

甲醇、氨水、甲酸、无水乙醇等分析纯，购于北京化学试剂有限公司；乙酸，购自J.T Baker公司；色谱级甲醇，购自美国Fisher公司；顺，反-脱落酸、反，反-脱落酸，购自成都生物技术有限公司；p-香豆酸、芥子酸、山柰酚、柯因和短叶松素-3-乙酸酯，均购自美国Sigma公司；试验用水为超纯水。

1.2 试验材料

赞比亚蜜样品产自赞比亚，于2016年购入，样品收集后置于4℃冰箱保存。

1.3 主要仪器与设备

微量移液器，德国Eppendorf公司产品；Seven Easy型pH计，梅特勒-托利多仪器上海有限公司产品；AL204型分析天平，梅特勒-托利多仪器责任有限公司产品；LC-6AD型高效液相色谱仪，日本岛津公司产品；Sorvall Biofuge Startos型台式离心机，美国Thermo Fisher公司产品；1290型超高效液相色谱仪，UHPLC，6540四级杆-飞行时间质谱（QTOF MS），安捷伦科技发展有限公司产品；Strata-X-A型固相萃取柱，广州菲罗门科学仪器有限公司产品；Milli-Q Intergral型纯水/超纯水一体化系统，美国Merk Millipore公司产品；24孔固相萃取装置，美国Supelco公司产品；真空微孔滤膜过滤装置，北京京辉凯业科技有限公司产品；0.22 μm微孔滤膜，天津津腾实验设备有限公司产品；无菌注射器，广东康尔美医疗器械有限公司产品。

1.4 试验方法

1.4.1 蜂蜜样品的前处理

试验所用方法是在Dimitrova[10]和孙春丽[11]的基础上进行了改进，具体操作流程如下：①用固相萃取柱对赞比亚蜜进行前处理，首先4 mL分析级甲醇对Strata-X-A固相萃取柱活化，再用4 mL超纯水（pH值为7）对Strata-X-A固相萃取柱平衡；②配置0.25 g/mL的蜂蜜水，搅拌（若蜂蜜样品结晶，可进行超声混匀）。然后用稀氨水缓慢调节，使蜂蜜溶液pH值为7；③用离心机除去蜂蜜中的固体杂质，离心条件为8 000 g/12 min，取上清液倒入固相萃取柱中；④取萃取后的柱子，用3 mL pH值为7的超纯水进行洗脱，主要去除粘在柱子上的糖类化合物和其他杂质，再用5 mL含5%甲酸的分析级甲醇溶液进行洗脱；⑤将洗脱液收集于试管中，并用氮吹仪（配有恒温水浴锅）吹干，再用2 mL色谱级甲醇进行酚类化合物的复溶，最后过0.22 μm滤膜后存放于样品瓶中，4℃冰箱中保存，备用。

1.4.2 赞比亚蜂蜜的HPLC色谱分析条件和质谱分析条件

（1）HPLC色谱分析条件。色谱柱：150 mm× 4.6 mm，5 μm（Phenomenex Gemini C18），具体参数设置为柱温箱温度35℃，检测波长280 nm，进样量20 μL。流动相：A相是水（含有2%的乙酸），B相是甲醇（含有2%的乙酸），总流速0.7 mL/min。

赞比亚蜜的梯度洗脱程序见表1。

表1 赞比亚蜜的梯度洗脱程序

总体洗脱时间为135 min，流动相甲醇的质量分数从9%变化到80%。

（2）质谱分析条件。电离源为电喷雾离子化（ESI），检测器是正、负离子双检测模式，加热温度至350℃，离子源喷出的电压4.5 kV，出口电压130 V，氮气（N2）的流速12 L/min，碰撞气体为氦气，雾化气的速度80 kPa，雾化器的压力40 psi，扫描范围在60～800 Da。

1.4.3 配制标准品溶液

称取一定质量的p-香豆酸、顺，反-脱落酸、反，反-脱落酸、芥子酸、柯因、短叶松素-3-乙酸酯和山奈酚，配置成10 mL标准品储备液。将不同的标准品溶液分别以5，10，15，20，25 μL进样量进行HPLC色谱分析，根据峰面积和不同的标准品进样量建立各个标准品的标准曲线。

各个不同标准品的线性回归方程和相关系数见表2。

表2 各个不同标准品的线性回归方程和相关系数

2 试验结果与分析

2.1 赞比亚蜜样品中多酚类化合物的定性分析

赞比亚蜜样品HPLC色谱图见图1。

在已经试验的基础上，采用对蜂蜜中酚酸类化合物的吸附和回收效果最好的Strata-X柱进行赞比亚蜜的前处理，检测出赞比亚蜜中7种多酚类化合物。赞比亚蜜中的化合物名称、在赞比亚蜜梯度洗脱程序中的相对保留时间、紫外光谱的最大吸收波长、化合物的分子质量以及在质谱上的具体信息详见表3。

图1 赞比亚蜜样品HPLC色谱图

图2 正、负离子双模式下检测的p-香豆酸的质谱图

图3 正、负离子双模式下检测的芥子酸的质谱图

表3 赞比亚蜜样品中化合物和MS，UV以及Rt特征

赞比亚蜜样品中化合物和MS，UV以及Rt特征见表3。

按照上述的质谱条件，测定赞比亚蜜中7个色谱峰之一（1号峰）的准分子量。

正、负离子双模式下检测的p-香豆酸的质谱图见图2。

在图2（a）中的正离子双模式下质谱图中含有1个165.054 6 m/z[M+H]+的准分子离子碎片峰和一个187.1129 m/z[M+Na]+的准分子离子碎片峰；在图2（b）负离子双模式检测的的质谱图中存在1个163.039 3 m/z[M-H]-准分子离子碎片峰。结合表3中p-香豆酸的MS值的相关信息以及标准品的对比，由此可以推断，分子量是164，该化合物应为p-香豆酸。

按照上述质谱条件，测定赞比亚蜜中7个色谱峰之一（2号峰）的准分子量，结果见正负离子质谱图。

正、负离子双模式下检测的芥子酸的质谱图见图3。

在图3（a）中的正离子质谱图里含有1个225.123 0 m/z[M+H]+的准分子离子碎片峰和1个247.102 5 m/z[M+Na]+的准分子离子碎片峰；在图3（b）负离子模式的质谱图中包含有223.061 1 m/z [M-H]-的准分子离子碎片峰。结合表3中芥子酸的MS值的相关信息以及标准品的对比，由此可以推断，分子量是224，该化合物应为芥子酸。

按照上述的质谱条件，测定赞比亚蜜中7个色谱峰之一（3号峰）的准分子量，结果见正负离子质谱图。

正、负离子双模式下检测的反，反-脱落酸的质谱图见图4。

在图4（a）中的正离子质谱图里含有1个265.118 6 m/z[M+H]+的准分子离子碎片峰和1个287.094 8 m/z[M+Na]+的准分子离子碎片峰；在图4（b）中的负离子模式检测的质谱图里含有1个263.129 5 m/z[M-H]-的准分子离子碎片峰。结合表3中反，反-脱落酸的MS值的相关信息以及标准品的对比，可以推断，分子量为264，该化合物是反，反-脱落酸。

按照上述质谱条件，测定赞比亚蜜中7个色谱峰之一（4号峰）的准分子量，结果见正负离子质谱图。

正、负离子双模式下检测的顺，反-脱落酸的质谱图见图5。

图4 正、负离子双模式下检测的反，反-脱落酸的质谱图

图5 正、负离子双模式下检测的顺，反-脱落酸的质谱图

在图5（a）中的正离子质谱图里含有1个287.095 2 m/z[M+Na]+的准分子离子碎片峰；在图5（b）的负离子模式检测的质谱图里含有1个263.120 5 m/z[M-H]-的准分子离子碎片峰。结合表3中顺，反-脱落酸的MS值相关信息以及标准品的对比，可以推断：该化合物的分子量为264，该化合物是顺，反-脱落酸。

按照上述的质谱条件，测定赞比亚蜜中7个色谱峰之一（5号峰）的准分子量，结果见正负离子质谱图。

正、负离子双模式下检测的山奈酚的质谱图见图6。

从图6可知，负离子模式的质谱图中包含有285.041 0 m/z[M-H]-准分子离子碎片峰；图6（a）的正离子模式的质谱图里含有1个309.035 7 m/z [M+Na]+的准分子离子碎片峰和287.054 5 m/z[M+H]+的准分子离子碎片峰。结合表3中山奈酚的MS值相关信息以及标准品的对比，可以推断其分子量为286，该化合物为是山奈酚。

按照上述的质谱条件，测定赞比亚蜜中7个色谱峰之一（6号峰）的准分子量，结果见正负离子质谱图。

正、负离子双模式下检测所得到的短叶松素-3-乙酸酯的质谱图见图7。

图6 正、负离子双模式下检测的山奈酚的质谱图

图7 正、负离子双模式下检测所得到的短叶松素-3-乙酸酯的质谱图

在图7（a）中的正离子质谱图里含有1个315.050 2 m/z[M+H]+的准分子离子碎片峰；在图7（b）负离子模式的质谱图中包含有313.238 5 m/z [M-H]-准分子离子碎片峰。结合表3中短叶松素-3 -乙酸酯的MS值相关信息以及标准品的对比，可以推断其分子量是314，该化合物应为短叶松素-3-乙酸酯。

按照上述质谱条件，测定赞比亚蜜中7个色谱峰之一（7号峰）的准分子量，结果见正负离子质谱图。

正、负离子双模式下柯因的质谱图见图8。

从图8（a）可以看出，正离子质谱图中包含有255.067 5 m/z[M+H]+的准分子离子碎片峰和287.091 0 m/z[M+Na]+的准分子离子碎片峰，在图8（b）的负离子质谱图中含有1个253.087 2 m/z[M-H]-的准分子离子碎片峰。结合表3中MS值相关信息以及标准品的对比，因此可以推测其分子量为254，该化合物为柯因。

2.2 赞比亚蜜样品中多酚类化合物的定量分析

赞比亚蜜样品中的多酚类化合物和脱落酸见表4。

图8 正、负离子双模式下柯因的质谱图

表4 赞比亚蜜样品中的多酚类化合物和脱落酸

赞比亚蜜样品中共鉴定出7种化合物，包括2种酚酸类化合物，3种黄酮类化合物和2种脱落酸。赞比亚蜜样品的酚酸含量平均值为15.79 μg/100 g，黄酮含量平均值为35.40 μg/100 g。此外，在鉴定出的所有化合物中，柯因的含量最高，为51.44 μg/100 g。研究表明，柯因是合成降血脂、防心脑血管疾病、抗菌、消炎等药品的原料[12-13]。根据试验结果推断，柯因或许是赞比亚蜜具有降血压作用的一个关键性因素。脱落酸的含量仅次于柯因，并且在赞比亚蜜中鉴定出2种脱落酸，分别为反，反-脱落酸和顺，反-脱落酸。脱落酸（ABA）是植物五大天然生长调节剂之一，能够应对外界环境的变化，保护植物生长。研究表明，蜂蜜中一般均含有脱落酸，也有报道证明脱落酸具有明显的抗氧化作用。

3 结论

通过固相萃取-高效液相色谱法结合LC-MS/MS研究了赞比亚蜜样品中多酚类化合物成分及含量。共检测出7种多酚类化合物，包括p-香豆酸、脱落酸、芥子酸、短叶松素-3-乙酸酯、山奈酚以及柯因。其中，以柯因的含量为最高，脱落酸次之。旨在为赞比亚蜜的开发和利用提供理论参考依据，为进一步研究赞比亚蜜中的营养学和生物学功能奠定了良好的基础，以期为开发赞比亚特色蜂蜜提供一定的理论依据。

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The Study of Polyphenolson Zanbia Honey

ZHAO Hongyu1，2，ZHANG Gensheng1，*ZHANG Hongcheng1，2
（1.Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150010，China；2.Institute of Bees，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100093，China）

As Zambia unique precious honey，Zambia honey have obvious effect in lowering blood pressure than other varieties.In this study，solid-phase extraction-high performance liquid chromatography coupled with LC-MS/MS is used to study the composition and content of polyphenols in honey samples from Zambia.The results show that abscisic acid，sinapic acid，p-coumaric acid，pinobanksin-3-acetate，kaempferol and chrysine are found in Zambia honey samples.Among them，the highest content of Chrysine have 51.44 μg/100 g，abscisic acid followed.

Zambia honey；polyphenols；HPLC；LC-MS/MS

O614

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.03.001

1671-9646（2017）03a-0001-05

2017-01-11

国家蜂产业技术体系资助项目（CARS-45-KXJ18）。

赵宏玉（1992—），女，在读硕士，研究方向为蜂产品应用与加工。

*通讯作者：张红城（1967—），男，博士，副研究员，研究方向为功能食品与生物活性物质、食品生物技术。