ND3在自发性糖尿病长爪沙鼠5种组织中的表达

李银银, 龚菁菁, 吴绍亮, 李小红, 王存龙, 霍学云, 路 静,吕建祎, 刘 欣, 郭 萌,2, 李长龙, 陈振文, 杜小燕,2

(首都医科大学 1. 基础医学院; 2. 实验动物部, 北京100069; 3. 山东省临沭县人民医院, 临沭 276700)

ND3在自发性糖尿病长爪沙鼠5种组织中的表达

李银银1, 龚菁菁1, 吴绍亮3, 李小红1, 王存龙1, 霍学云1, 路 静1,吕建祎1, 刘 欣1, 郭 萌1,2, 李长龙1, 陈振文1, 杜小燕1,2

(首都医科大学 1. 基础医学院; 2. 实验动物部, 北京100069; 3. 山东省临沭县人民医院, 临沭 276700)

目的 分析糖尿病长爪沙鼠5种组织中ND3基因在mRNA和蛋白水平的表达，以期探索长爪沙鼠糖尿病模型中ND3的作用及其靶器官。方法 选取血糖正常对照组沙鼠和糖尿病实验组沙鼠各6只，分别采集动物的肾脏、肝脏、骨骼肌、脑和心脏组织，采用实时定量PCR和Western blotting方法检测在各组织中ND3 mRNA和ND3蛋白水平表达状况。结果 与对照组动物相比，糖尿病长爪沙鼠ND3 mRNA表达水平在肾脏组织中极显著升高，肝脏和肌肉组织中则显著降低，脑组织中仅有降低趋势，而在心脏组织中仅有升高趋势。检测ND3蛋白水平表明，除心脏组织外，其他组织均与mRNA水平表达结果一致。结论 肾脏组织可能是糖尿病长爪沙鼠ND3基因作用的主要部位，同时在其他4种组织中该基因也发挥着一定作用。

长爪沙鼠; 2型糖尿病; ND3基因; 实时定量PCR; Western blotting

糖尿病是严重威胁人类健康的重大疾病之一，近半个世纪来，其患病率和死亡率呈明显上升趋势，在我国已成为继心血管疾病、肿瘤之后位列第三的常见病、多发病和慢性非传染性疾病[1]。其中2型糖尿病即非胰岛素依赖型是糖尿病的主要类型[2]。2型糖尿病是由遗传因素和环境因素共同作用导致的复杂遗传病，以葡萄糖耐量降低、胰岛素抵抗为主要特征[3]。本研究室前期通过定向培育的方法初步筛选到一只糖尿病长爪沙鼠近交系模型，其具有空腹血糖升高、糖耐量受损、胰岛素抵抗和瘦素抵抗、脂联素水平降低等2型糖尿病模型特征，且具有遗传性[9]。

由于糖尿病是多基因控制复杂疾病, 2型糖尿病的发病机制目前仍不完全清楚, 易感基因的存在及其功能改变可能是影响糖尿病发生的重要因素[4]。作者前期[5]通过抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)的方法在自行培育的近交系高血糖长爪沙鼠和正常血糖长爪沙鼠骨骼肌中发现烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位3(NADH dehydrogenase 3，ND3)基因表达有差异，但其在遗传性2型糖尿病长爪沙鼠不同组织中的表达情况还不够清楚。因此，本实验旨在对ND3在糖尿病沙鼠和正常沙鼠的肾脏、肝脏、骨骼肌、脑和心脏组织中mRNA和蛋白水平的表达情况进行分析，以期探索长爪沙鼠糖尿病模型致病机制中ND3的作用和靶器官，为长爪沙鼠2型糖尿病新模型的发生机制研究提供新的切入点。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择

选取近交系糖尿病模型长爪沙鼠和正常对照组沙鼠各6只, 12～15周龄, 雌雄各半。所有动物均来自首都医科大学实验动物部[SCXK(京)2015-0009], 于温湿度控制的普通环境中饲养[SYXK(京)2013-0005]。

1.2 样品采集

糖尿病和正常长爪沙鼠均用过量戊巴比妥溶液腹腔注射麻醉施行安死术，快速采集新鲜的肾脏、肝脏、骨骼肌、脑和心脏等5种组织后立即置于液氮中冻存待用。

1.3 仪器和试剂

仪器: 研磨珠均质器(BioSpec, 美国); 低温高速离心机(Eppendorf Centrifuge 5417R, Eppendorf, 德国); Nanodrop 2000c(Thermo Scientific, 美国); PCR仪(Applied Biosystems, 美国); Bio-Rad CFX96 manager System; 电泳仪、电转仪和凝胶图像分析系统(Bio-Rad, 美国)。

试剂: 戊巴比妥(北京化学试剂公司); TRIzol Reagent 试剂(Invitrogen, 美国); 三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇(北京畅力通有限公司, 北京); 快速反转录试剂盒(Fast Quant RT Kit)和实时定量PCR试剂盒(SuperReal PreMix Plus, SYBR Green)(天根生化科技有限公司, 北京); 组织蛋白提取试剂盒和二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)蛋白定量试剂盒(康为世纪生物科技有限公司, 北京); ND3抗体(Abcam, 英国)。

1.4 各组织RNA提取及cDNA的制备

将长爪沙鼠5种组织从液氮中取出, 剪取部分组织于均质管中, 分别加入约1 mL TRIzol Reagent试剂后进行组织破碎, TRIzol试剂法抽提组织总RNA[6]。得到RNA沉淀晾干后, 加入适量不含RNase水溶解得组织总RNA。采用Nanodrop 2000c分析RNA浓度和纯度。使用快速反转录试剂盒对上述总RNA样品进行逆转录。首先用试剂盒所含gDNase, 42 ℃孵育3 min后去除基因组DNA, 利用试剂盒所含高效反转录酶在42 ℃条件下先孵育15 min, 接着95 ℃再孵育3 min, 完成反转录得到相应的cDNA低温保存, 用于后续实验。

1.5 实时定量PCR

按照SSH得到的ND3基因片段序列，利用Primer Premier 5.0 设计PCR扩增引物3对并优化选择, 最终使用ND3-1引物(表1)进行实验。5种组织均选取β-actin基因作为内参基因并设计引物(表1)。各引物均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

采用实时定量 PCR法在Bio-Rad CFX96 managerSystem上对ND3的mRNA水平进行检测。所用试剂盒为实时定量PCR试剂盒, 反应体系总为20 μL。体系中包含如下组分: 2×Super Real PreMix Plus 10 μL,上游引物0.6 μL, 下游引物0.6 μL, 模板cDNA 1 μL, RNase-Free H2O 7.8 μL。反应程序均为: 95 ℃15 min,之后95 ℃10 s, 59.1 ℃30 s, 共循环40次，每个循环结束时检测荧光; 从60 ℃到95 ℃分析熔解曲线,每增加0.5℃检测一次。

表 1 ND3和内参基因实时定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence of ND3 and internal control genes for Real time-PCR

1.6 Western blotting

取液氮冻存的长爪沙鼠肾脏、肝脏、骨骼肌、脑和心脏等5种组织于均质管中, 剪碎后用组织蛋白提取试剂盒提取组织总蛋白, 采用BCA定量法对蛋白进行定量。取30 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，半干法电转蛋白至NC膜。以TBST (25 mmol/L Tris-base，0.15 mol/L NaCl，0.05% Tween-20，pH7.5)含5%脱脂牛奶封闭膜过夜。用ND3抗体(1∶1 000稀释) 4℃孵育过夜，TBST洗涤3次后与第二抗体(辣根过氧化酶联的抗兔血清)室温孵育1 h，TBST洗膜后用化学发光法显色。5种组织均选用GAPDH作为内参蛋白。最后用凝胶图像分析系统扫描蛋白质印迹条带灰度。

1.7 统计学处理

所有数据均采用SPSS 16.0软件进行统计分析。两组间比较采用独立样本t检验方法分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 在糖尿病沙鼠和对照组的5种组织中ND3 mRNA 表达水平的差异

与对照组(Control)相比, 糖尿病组(DM)肾脏(Kidney)组织中ND3 mRNA的表达极显著升高(图1)，参照SSH的结果中，该基因在糖尿病沙鼠中的表达量高于正常沙鼠，该结果与消减杂交结果相一致。在肝脏(Liver)和肌肉(Muscle)组织中，ND3在糖尿病组的表达量均显著低于对照组，脑(Brain)组织mRNA表达量仅有下降趋势, 而在心脏(Heart)组织中，mRNA的表达仅有升高趋势。

2.2 在糖尿病沙鼠5种组织中ND3蛋白表达水平

Western blotting检测ND3蛋白在5种组织中的表达结果显示, 肾脏中糖尿病组的蛋白水平极显著高于对照组, 与实时定量 PCR的趋势结果一致(图2)。肝脏组织中ND3在糖尿病组中蛋白水平显著低于对照组，脑组织有极显著下降，均与其mRNA的表达水平趋势相一致。在心脏组织中，糖尿病组与对照组相比ND3蛋白也显著降低，而骨骼肌中仅有降低趋势。

3 讨论

2型糖尿病在糖尿病患者中占比达90%以上[7],因此多数相关研究是针对2型糖尿病发生机制的研究。2型糖尿病是由多基因控制的复杂内分泌代谢性疾病，因此用自发性糖尿病模型研究其分子遗传发生机制是理想的手段[8]。现有糖尿病动物模型包括实验诱导的、自发的及转基因小鼠、大鼠和猪，但都有不同程度的缺陷，如耗时、丢失基因表型等。本研究室前期[9]经过定向培育形成了一个自发性糖尿病长爪沙鼠模型群体，经研究证实其具有2型糖尿病特性，能够自发形成糖尿病并具有遗传性, 在群体中的发生率较高(目前培育到F17代，发生率在66%以上)，是对已有模型的重要补充。作者利用这一实验材料，通过SSH方法从骨骼肌中筛选到糖尿病和正常沙鼠差异表达的基因ND3，并对该基因进行了不同组织器官的表达水平研究。

由于2型糖尿病会影响一些外周组织和核心器官的代谢和功能[10]，作者选取了肾脏、肝脏、骨骼肌、脑和心脏组织进行ND3基因表达水平的研究。有报道[11]称线粒体基因变异与2型糖尿病的发生存在一定的相关性。ND3是由线粒体ND3基因编码的蛋白质, ND3变体与线粒体脑肌病伴乳酸血症和卒中样发作有关，以及与Leigh综合征、亚急性坏死性脑病和Leber氏遗传性视神经病相关[12]。由于线粒体ND3基因所表达的酶亚单位是呼吸链复合物I的重要组成部分，理论上β细胞ND3基因缺陷会导致呼吸链复合物I活性降低，从而引起胰岛β细胞功能障碍使糖尿病发病成为可能，则ND3在2型糖尿病致病机制中可能发挥着重要作用[13]。

图 1 ND3在沙鼠5种组织mRNA表达水平A-E: The relative mRNA expression levels of ND3 in 5 tissues (kidney, liver, muscle, brain and heart) between both groups of gerbils. Results were normalized to the housekeeping gene β-actin(n=6,*P＜0.05,**P＜0.01)Figure 1 mRNA expression level of ND3 in 5 tissues from control and diabetic gerbils

图 2 ND3在沙鼠5种组织中蛋白的表达A-E: The relative protein expression levels of ND3 in 5 tissues (kidney, liver, muscle, brain and heart) between control and diabetic gerbils. 1 to 6 are from control group, 7 to 12 are from diabetes group. Below the bands of gray scan, semi-quantitation of data shown corresponding statistics determined by using Image J (n=6,*P＜0.05,**P＜0.01)Figure 2 Protein expression level of ND3 in 5 tissues from diabetic and control gerbils

本文中糖尿病长爪沙鼠肾脏组织ND3 mRNA和ND3蛋白表达水平均有升高(P＜0.01)。糖尿病性肾病是糖尿病慢性并发症之一[14]，肾脏中糖尿病相关的血糖紊乱、微血管病变可致慢性肾功能不全、蛋白尿以及肾小球病变[15,16]。有研究表明[17]ND3变异可能引起线粒体氧化磷酸化作用的缺失，以及与糖尿病肾病、肌肉萎缩和脂肪肝等相关。本文结果还表明，糖尿病长爪沙鼠的肝脏中ND3的转录和翻译水平降低，而肝脏是血糖代谢调节的重要器官，当血糖浓度较高时，肝脏通过合成肝糖原及脂蛋白来降低血糖浓度；血糖浓度较低时，肝脏通过肝糖原分解或糖异生作用升高血糖。因此，在糖尿病动物中其线粒体氧化供能作用降低，由此可能引起ND3的表达水平也降低[18]。

骨骼肌是葡萄糖吸收和脂肪酸氧化最大的器官，在胰岛素的作用下吸收人体大部分的血糖以进行肌肉的有氧和无氧呼吸，因此它对全身糖代谢起非常重要作用[19]，而ND3基因的缺失会导致线粒体氧化吸收葡萄糖作用降低，呼吸作用受影响。本研究检测到2型糖尿病模型长爪沙鼠肌肉中ND3的表达降低可能也与肌肉中该基因的变异有关。糖尿病患者脑内线粒体利用葡萄糖产生大量活性氧导致机体发生氧化应激，影响脑部神经电生理和病理状态[20]。并且有研究表明[21]线粒体ND2基因C5178 A多态性与2型糖尿病患者并发心脑血管病有密切关系，同为线粒体电子呼吸链上复合体I的编码基因之一，ND3基因在本研究中也在心脏和脑组织中有mRNA和蛋白水平的表达变化。

综上所述，作者对长爪沙鼠糖尿病模型研究表明，肾脏组织可能是糖尿病长爪沙鼠ND3基因作用的主要部位，同时在其他4种组织中该基因也发挥着一定作用，这一结果或可对利用长爪沙鼠深入研究2型糖尿病发生的分子机制提供新的思路。

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Expression of ND3 in 5 Tissues of Hereditary Diabetic Mongolian Gerbils

LI Yin-yin1, GONG Jing-jing1, WU Shao-liang3, LI Xiao-hong1, WANG Cun-long1, HUO Xue-yun1, LU Jing1, LV Jian-yi1, LIU Xin1, GUO Meng1,2, LI Chang-long1, CHEN Zhen-wen1, DU Xiao-yan1,2
(1. School of Basic Medical Science; 2. Department of Laboratory Animal, Capital Medical University, Beijing 100069, China; 3. The People’s Hospital of Linshu, Linshu 276700, China)

Objective To investigate the mRNA and protein expression level of NADH dehydrogenase 3(ND3) gene in 5 different tissues of diabetic gerbils, to understand the location and target tissue of ND3 in diabetic gerbil model. Methods Six gerbils for control and diabetic groups were selected respectively. The kidney, liver, skeletal muscle, brain and heart from each group were collected. The mRNA and protein expression of ND3 were evaluated by Real time-PCR and Western blotting in both groups. Results The mRNA expression of ND3 in diabetic group was extremely significantly increased in kidney, and significantly decreased in liver and skeletal muscle compared with those of control animal. While it just showed decreasing tendency in brain and increasing tendency in heart tissue. The detection of protein expression showed that the protein level was consistent with mRNA expression in all tissues except heart. Conclusions The kidney may be the target tissue of ND3 in diabetic gerbil. In addition, ND3 also exhibits effect in other 4 tissues of diabetic gerbil.

Mongolian gerbils; Type 2 diabetes; ND3; Real-time PCR; Western blotting

Q95-33

A

1674-5817(2017)01-0006-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.01.002

2016-09-30

国家科技支撑计划(No. 2015BAI09B01); 国家自然科学基金 (Nos. 31272393, 31572348); 北京自然基金(No. 7141002)

李银银(1989-), 女, 硕士研究生, 专业: 实验动物学。E-mail: yyl7590@163.com

杜小燕(1971-), 女, 博士, 副教授。主要从事实验动物教学和研究。E-mail: duduyan@ccmu.edu.cn