Tamoxifen诱导敲除多囊肾小鼠Pkd1基因后的肾脏病理变化

周卫民, 朱科燕, 陈方明, 蔡月琴, 方明笋, 齐月寒, 陈民利

(浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究中心, 杭州 310053)

Tamoxifen诱导敲除多囊肾小鼠Pkd1基因后的肾脏病理变化

周卫民, 朱科燕, 陈方明, 蔡月琴, 方明笋, 齐月寒, 陈民利

(浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究中心, 杭州 310053)

目的 探讨Tamoxifen诱导下敲除Pkd1f/f:Cre转基因小鼠多囊肾病1(Pkd1)基因前后的肾功能变化情况。方法 选用出生11 d的Pkd1f/f:Cre转基因小鼠和Pkd1f/f野生型小鼠用Tamoxifen进行诱导, 分别于诱导后7 d、14 d、21 d检测血清肌酐与尿素氮含量, 检测21 d时体质量、肾脏重量及其脏器系数。结果 诱导敲除后7 d小鼠血清肌酐与尿素氮含量开始升高, 14 d、21 d小鼠血清肌酐与尿素氮含量明显升高(P＜0.01)。21 d时诱导敲除小鼠肾脏系数明显高于未敲除小鼠。 结论 Tamoxifen能使条件诱导敲除pkd1基因的小鼠肾功能产生明显改变, 肾组织出现大量囊泡症状。

多囊肾(PKD); 转基因小鼠; 肾功能; Tamoxifen; 诱导

随着医药卫生事业的发展，转基因小鼠已成为生命科学研究中不可缺少的实验动物模型。多囊肾(polycystic kidney disease，PKD)是一种常染色体显性遗传并以双肾出现无数圆形液性囊泡为主要特征疾病。Pkd1f/f:Cre转基因小鼠是条件敲除小鼠，在条件诱导敲除后，除了肾脏外，其他器官组织不会发生囊泡样病理组织变化。为了探讨在本实验室情况下经Tamoxifen诱导后多囊肾Pkd1f/f:Cre转基因小鼠在不同时间段肾功能的变化，本研究分别在诱导前后各时间点对Pkd1f/f:Cre转基因小鼠和Pkd1f/f野生型小鼠进行肾脏病理及血清肌酐(以下简称CREA)和血清尿素氮(以下简称BUN)进行检测。

1 材料与方法

1.1 动物

由瑞士苏黎世大学赠送的Pkd1f/f:Cre转基因小鼠，在本中心得到稳定的保种及传代[SCXK(浙) 2013-0054]，每只小鼠都经PCR进行DNA基因型鉴定。以上实验动物使用3R原则给予人道关怀。小鼠均饲养于屏障系统的IVC笼具中，相对湿度50%～70%，温度: 22±1℃，15～20次/h的换风次数，12 h明暗交替，噪音小于50 dB，由电脑自动控制温度、湿度、光照、压力梯度等指标[SYXK(浙)2013-0184]。

1.2 试剂和仪器

日立7020全自动生物化学分析仪, 日本日立公司; HM 335E型轮转切片，德国Microm公司; Leica ST501染色机，德国Leica公司; AP280组织包埋机、全自动脱水机，德国Microm公司; AG204-电子分析天平，瑞士METTLER公司。BUN试剂盒: 07248/00002221, CREA试剂盒:171036/50003007, 生产厂家:德赛诊断系统(上海)有限公司，Tamoxifen和棉籽油由美国Sigma公司提供。

1.3 Tamoxifen诱导

出生11 d的Pkd1f/f:Cre转基因小鼠和Pkd1f/f野生型小鼠经腹腔注射Tamoxifen 10 mg/kg, (Tamoxifen用棉籽油溶解)。

1.4 CREA和BUN测定

各组小鼠在Tamoxifen诱导后7 d、14 d、21 d,在小鼠颌下静脉处用采血针采血, 经3 000 r/min离心10 min，分离上清血清，用日立7020全自动生物化学分析仪对CREA和BUN测定。

1.5 肾组织的脏器系数

Tamoxifen诱导后21 d，各组小鼠进行称重、采用CO2施行安死术, 解剖取肾脏组织, 称重, 并计算脏器系数(=脏器重量/体质量)。

1.6 组织病理学观察

取肾脏组织用体积分数10%中性甲醛溶液固定24 h后, 乙醇脱水, 石蜡包埋, 切片, 进行HE染色和PAS染色, 光学显微镜下观察肾组织病理学变化。

1.7 数据处理

2 结果

2.1 血清CREA变化

Tamoxifen诱导后7 d, Pkd1f/f:Cre诱导组CREA与Pkd1f/f:Cre未诱导组及Pkd1f/f野生型组比较有升高趋势(P＞0.05); 诱导后14 d、21 d, Pkd1f/f:Cre诱导组CREA与Pkd1f/f:Cre未诱导组及Pkd1f/f野生型组比较，有极显著升高(P＜0.01); 各时间点CREA在Pkd1f/f:Cre未诱导组与Pkd1f/f野生型诱导组和未诱导组间比较无明显差异, Pkd1f/f野生型诱导组与Pkd1f/f未诱导组比较无明显差异(表1)。

2.2 血清BUN变化

Tamoxifen诱导后7 d, Pkd1f/f:Cre诱导组BUN与Pkd1f/f:Cre未诱导组及Pkd1f/f野生型组比较有升高趋势(P＞0.05), 与Pkd1f/f野生型未诱导组比较有显著差异(P＜0.05)。诱导后14 d、21 d, Pkd1f/f:Cre诱导组BUN与Pkd1f/f:Cre未诱导组及Pkd1f/f野生型组比较有极显著升高(P＜0.01); 其他三组间比较无明显差异(表2)。

2.3 体质量、肾脏重量及系数

Tamoxifen诱导后21 d, Pkd1f/f:Cre诱导组体质量与Pkd1f/f:Cre未诱导组、Pkd1f/f野生型诱导组、Pkd1f/f野生型未诱导组比较有极显著减轻(P＜0.01); Pkd1f/f:Cre诱导组肾脏重、肾脏系数与Pkd1f/f:Cre未诱导组、Pkd1f/f野生型诱导组、Pkd1f/f野生型未诱导组比较有极显著增加(P＜0.01); 体质量、肾脏重量及系数在其余三组间比较无差异(表3)。

2.4 肾脏组织病理学观察

Pkd1f/f:Cre小鼠经Tamoxifen诱导后产生多嚢肾，肾体积比没有囊肿的肾大1倍左右，包膜紧张，颜色变淡，呈现水肿的病理变化，并见肾表面粗糙坑洼(图1 A1、A2); 多嚢肾肾皮质层充满圆形囊肿, 其大小不一, 圆囊内充满液体，在光学显微镜下，可见多嚢肾仅在各圆形囊肿间存在少量的完整肾结构，呈现肾小球硬化，肾小管萎缩、肾间质纤维化，气球样变性, 白细胞浸润等(图1B1、C1)。无囊肿肾脏表面光滑，色泽红润，肾组织结构完整，肾小球、肾小管排例有序，清晰可见(图1B2、C2)。

表 1 小鼠血清CREA变化Table 1 Serum CREA changes of mice μmol/L

表 2 小鼠血清BUN变化Table 2 Serum BUN changes of mice mmol/L

表 3 诱导21 d小鼠体质量、肾脏重量及系数变化Table 3 Body weight, kidney weight and organ coefficients of mice after 21 days induction

3 讨论

多囊肾是一种常染色体显性遗传肾病, 其两侧肾脏均可发生囊肿, 还会影响其他器官, 可发生肝、脾、胰囊肿，还会形成颅内动脉瘤、发生二尖瓣脱垂的心脏疾病，是一种全身性系统性疾病[1-3]。与PKD发病有关基因已发现2个，其中PKD1基因定位于染色体16p13-3，其突变约占PKD的85%; PKD2基因定位于4q21～23，其突变约占15%[4]。

血清BUN测定是检查肾功能的主要指标之一，BUN是体内蛋白质代谢和氨基酸分解的终产物，主要经肾小球过滤随尿液排出体外，BUN的高低会受诸多因素的影响，如高蛋白饮食等，BUN的产生均明显增加而使血清中BUN增高。常用检测血清CREA的含量方法来了解肾功能的情况，血清中CREA浓度主要由肾小球滤过功能决定的, 肾小球滤过功能减退时, 血清中CREA可升高。

图 1 Tamoxifen诱导后21 d小鼠肾脏病理变化Figure 1 The pathological changes of kidney in mice after 21 days Tamoxifen induction

多囊肾Pkd1f/f:Cre转基因小鼠是有条件目标PKD1等位基因[5]敲除小鼠，并结合有选择性的Cre重组酶，当重组酶Cre被Tamoxifen诱导之后，Cre表达，介导两个LoxP位点序列的重组，从而把目标PKD1等位基因(LoxP-Pkd1-LoxP)敲除，在条件诱导敲除后，除了肾脏外，其他器官组织不会发生囊泡样病理组织变化[6]。研究表明[7]，在小鼠10～12日龄进行诱导，诱导后，PKD1等位基因(LoxP-Pkd1-LoxP)敲除的小鼠一般实验都可做到35～38日龄，本实验在小鼠11日龄，用棉子油溶解的Tamoxifen(10 mg/kg)按体质量对小鼠进行腹腔注射诱导敲除，随着小鼠的生长，小鼠状态越来越差，在32日龄开始死亡，比研究资料[7]显示的存活时间要短。由诱导后7 d、14 d、21 d的BUN和CREA测定结果表明，在诱导敲除后7 d的BUN和CREA已开始上升，表明肾小球滤过功能已受到影响。在诱导敲除后14 d、21 d的BUN和CREA明显高于未敲除的小鼠，21 d时BUN升高3倍多，CREA升高2倍多(均P＜0.01)，在21 d时敲除小鼠的肾脏重量是没有敲除小鼠的2倍，肾脏器系数3～4倍，体质量下降明显，表明诱导敲除后，随着时间的延长，小鼠肾功发生了进行性恶化，肾中囊泡增多，逐渐挤压正常的肾小球和组织，影响血液循环，使肾小球硬化，肾小管萎缩、肾间质纤维化, 并出现肾衰症状, 采食量减少, 体质量下降。此转基因小鼠的发病特点与人类常染色体显性遗传引起的多囊肾发病进程较一致，此研究为该转基因小鼠的推广利用提供数据，为研究多囊肾病分子发病机理、研发多囊肾病新药提供有用的模型。

[1] 梅长林, 李 林. 常染色体显性遗传性多囊肾病分子遗传、发病机制及治疗进展[J]. 肾脏病与透析肾移植杂志, 2001, 10(5):454-460.

[2] Omori S, Hida M, Fujita H, et al. Extracellular signa l-regulated kinase inhibition slows disease progression in mice with polycystic kidney disease[J]. J Am Soc Nephrol, 2006,17 (6):1604-1614.

[3] Hughes P, Robati M, Lu W, et al. Loss of PKD1 and loss of Bc-l 2 elicit polycystic kidney disease through distinct mechanisms[J]. Cell Death Differ, 2006, 13(7):1123-1127.

[4] 高晋生, 杨宝学. 常染色体显性遗传多囊肾病的治疗研究进展[J]中国药理学通报, 2009, 25(2):141-144.

[5] Shibazaki S, Yu Z, Nishio S, et al. Cyst formation and activation of the extracellular regulated kinase pathway after kidney specific inactivation of Pkd1[J] Hum Mol Genet, 2008, 17 (11):1505-1516.

[6] Baoxue Y, ND Sonawane, Dan Z, et al. Small-molecule CFTR inhibitors slow cyst growth in polycystic kidney disease [J]. J Am Soc Nephrol, 2008, 19(7):1300-1310.

[7] Leuenroth SJ, Bencivenga N, Chahboune H, et al. Triptolide reduces cyst formation in a neonatal to adult transition Pkd1 model of ADPKD[J] Nephrol Dial Transplant, 2010, 25(7): 2187-2194.

Pathological Change of Kidney in Pkd1 Knock-out Mice with Polycystic Kidney Induced by Tamoxifen

ZHOU Wei-min, ZHU Ke-yan, CHEN Fang-ming, CAI Yue-qing, FANG Ming-sun, Qi Yue-han, CHEN min-li
(Laboratory Animal Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

Objective To explore the change of kidney function of polycystic kidney disease (PKD) mice before and after the knockout Pkd1f/f: Cre gene induced by Tamoxifen induction. Methods The Pkd1f/f:Cre transgenic mice, Pkd1f/f:Cre wild type mice aged on 11 days were induced by Tamoxifen, the contents of serum creatinine and urea nitrogen were detected at 7 days, 14 days and 21days after induction. The body weight, kidney weight and the kidney viscera coefficient were detected after 21 day. Result After 7 days induction, the contents of serum creatinine and urea nitrogen began to rise after 14 days and 21 days induction, the parameters were significantly increased (P＜0.01) After 21 days induction, the kidney coefficient of knocked out transgenic mice kidney coefficient was higher than that of wild type mice. Conclusion The renal function of Pkd1f/f:Cre transgenic mice were obviously changed by Tamoxifen induction, the kidney of transgenic mice showed symptoms of a large number of vesicles.

Polycystic kidney disease (PKD); Transgenic mice; Kidney function; Induction

Q95-33

A

1674-5817(2017)01-0011-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.01.003

2016-10-27

浙江省公益性技术应用研究计划项目(2014C37009),浙江中医药大学比较医学创新团队(XTD201301)

周卫民(1979-), 男, 研究方向: 实验动物与动物实验。E-mail: zwm@zcmu.edu.cn

陈民利(1963-), 女, 教授, 研究方向: 实验动物与比较医学。E-mail: cmli991@aliyun.com