外固定架制作兔股骨延迟愈合模型

孔庆柱, 杨佳宁, 王贺龙, 赵胜军, 孔素红, 赵佳林, 金 宇

(承德医学院附属医院创伤小儿骨科, 承德 067000)

外固定架制作兔股骨延迟愈合模型

孔庆柱, 杨佳宁, 王贺龙, 赵胜军, 孔素红, 赵佳林, 金 宇

(承德医学院附属医院创伤小儿骨科, 承德 067000)

目的 使用外固定架制作兔股骨骨折延迟愈合模型。方法 将72只新西兰白兔随机分成对照组，实验A组、B组，将所有兔左侧股骨中段截骨，以微型可调节外固定架为固定装置，实验A组及B组去除10 mm皮质骨，同时去除内外骨膜及骨髓，实验A组保持骨折断端1 mm间隙，实验B组使用骨蜡封堵骨折断端，然后保持骨折断端接触。对照组截断骨皮质后即行外固定，不去除骨膜及骨髓。术后通过大体观察、影像学观察及组织学方法观察截骨端的愈合情况。结果 实验A组及B组愈合时间均为12周，对照组愈合时间为4周。结论 该实验建立的兔股骨骨折延迟愈合模型具有延迟愈合的X线及病理特征，说明该模型制作合理、可靠。

模型; 动物; 外固定器; 新西兰白兔; 股骨; 骨折; 不愈合

众所周知，骨折最常见的并发症是骨折延迟愈合及不愈合[1]，因此，骨折延迟愈合和不愈合也就成了骨科的热点问题，但仍有很多问题未能解决。在临床上，骨折延迟愈合是骨折不愈合的前期表现，很多骨折延迟愈合病人因未及时处理而使病情进展成为骨折不愈合。根据李冀等[2]调查，骨折不愈合在骨折术后并发症中发生率高达10%。

骨折延迟愈合的原因不仅是最初的高能量创伤所致的骨与血管的损伤，骨折的治疗方式也是其中之一[3]。虽然目前对骨折的治疗技术水平越来越高,但骨折延迟愈合的治疗却仍是一个棘手的难题。而不能及时处理骨折延迟愈合，则可能使其发展成为更为棘手的骨折不愈合。因此，骨折延迟愈合的积极治疗能有效地减少骨折不愈合的发生。

目前关于骨折不愈合的研究较多，而关于骨折延迟愈合的研究却很少[4]。关于利用兔制作骨折不愈合模型的研究相对较多，但骨折延迟愈合模型的研究却少之又少。本实验拟应用单边可调外固定架，制作新西兰白兔股骨骨折延迟愈合模型，为骨折延迟愈合建立一个客观的动物模型 ，为临床治疗提供实验支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

4～6月龄普通级新西兰白兔72只，体质量1.5～2.5 kg, 由承德医学院实验动物中心提供[SCXK (冀)2015-0100],饲养于清洁级环境下[SYXK(冀) 20014-0012]。将所有实验动物进行编号，使用随机数字法将兔分为实验A组、B组及对照组，每组24只。

1.2 模型建立方法

参照文献[5-7]方法制作兔股骨骨折延迟愈合模型。以兔左侧后肢为术侧，左大腿外侧为术区，使用电动褪毛器予术区褪毛。术前半小时肌注青霉素40万单位预防感染。使用体积分数3%戊巴比妥钠按照 1.0 mg/kg的剂量注入耳缘静脉进行麻醉，实验兔取左侧卧位固定于兔台上，保持其呼吸通畅，使用0.5%碘伏予术区消毒，常规铺无菌单。取兔大腿中部外侧纵形切口，逐层分离软组织，最大程度避免损伤软组织，于股外侧肌和股后肌之间的肌间隔钝性分离，充分暴露兔股骨干。分别于股骨远端及近端平行放置两枚1.5 mm外固定架螺纹钉，然后安装外固定架(图1左)，确保外固定架固定牢固。用线锯在股骨中段截骨，实验A组去除10 mm皮质骨(图1中)，同时去除内外骨膜及骨髓，去除后调节外固定架，保持骨折断端1 mm间隙，骨折断端不用骨蜡封堵; 实验B组去除10 mm皮质骨，同时去除内外骨膜及骨髓，去除后将骨折断端使用骨蜡封堵，然后调节外固定架，保持骨折断端接触；对照组截骨后不去除骨膜及骨髓，直接外固定架固定。截骨过程中反复用生理盐水冲洗截骨处，避免截骨周围骨膜及软组织因线锯截骨产热而受损。然后彻底止血，用生理盐水注射液及5%碘伏消毒液反复冲洗手术伤口后缝合,包扎伤口(图1右)。于清洁级环境下分笼饲养。术后每日肌肉注射青霉素40万单位，连续3 d，并每日2次用5%碘伏消毒液消毒伤口预防感染。

1.3 模型评价

分别于术后4周、8周、12周对各组动物行X线检查，并分别于4周、8周、12周处死8只兔，截取骨折断端骨痂软组织，取材包括骨折双侧正常骨端 0.3 cm, 行常规脱钙、脱水、透明及石蜡包埋, 5 μm连续切片, HE染色, 于20×20倍光学显微镜下进行组织学观察。

2 结果

2.1 大体观察

各组兔术后均可自由活动，3 d后恢复术前状态，步态无异常。实验期间，全部兔生长均正常，外固定架固定牢固。

2.2 X线检查

术后4周对照组兔骨折均愈合(图2A)。实验A组及B组兔均可见清晰骨折线(图2B、图2C)。8周时实验A组及B组兔骨折线模糊，可见较多骨痂(图2D、图2E)。12周除实验B组1只兔未愈合外，其余兔均愈合(图2F、图2G)，各组总体愈合率没有差异。

2.3 组织学检查

术后4周，对照组兔可见骨折断端连接良好(图3A)，实验A组及B组均为纤维瘢痕组织(图3B、图3C); 术后8周,实验A组及B组可见骨痂形成，软骨细胞向成骨细胞转化(图3D、图3E)。术后12周实验A组及B组可见骨折连接良好，骨折愈合(图3F、图3G)。

3 讨论

骨折愈合是一个复杂而连续的过程，分为三个阶段，分别为：血肿机化演进期; 原始骨痂形成期; 骨痂改造塑形期[8]。尽管骨折的愈合能力很强，但骨折不愈合在骨折术后并发症中发生率仍高达10%[2]。而骨折不愈合有一大部分的前期表现为延迟愈合，若骨折延迟愈合不及时处理则会导致骨折不愈合的发生。因此，骨折延迟愈合的治疗对于避免骨折愈合的发生也至关重要。

骨折的愈合时间一般为3个月，超过3个月未愈合则为延迟愈合。但该标准为人类愈合标准，通过对照组兔可得出兔骨折正常愈合时间为4周。

影响骨折愈合的因素有很多，如年龄、生活习惯、骨折类型、手术方式等。某一因素或者某几种因素都可能导致骨折的延迟愈合或不愈合。目前骨折延迟愈合的治疗方式分为手术治疗及非手术治疗[9]。但无论哪种治疗方式都需要大量的前期临床分析及动物实验提供理论支持才能应用于临床。因此，一种客观的动物模型的建立尤为重要。

目前关于骨不连模型的建立研究很多[10-12]，但骨折延迟愈合模型的研究却很少。Brownlow等[13]将新西兰长耳大白兔的胫骨截骨 ,彻底清除胫骨干长度的骨折断端骨膜及髓腔内组织 ,用外固定架固定骨折断端 ,同时调节外固定架使骨折断端保持 2 mm的间隙。术后第8周行X线及病理学检查，可见大量瘢痕组织，符合萎缩性骨不连的表现。Eckardt等[14]则将外固定架改为了内固定钢板，也成功建立了骨不连的模型。本实验是对Brownlow等方法的改进，同时实验B组采用骨蜡封堵断端，在骨蜡吸收之前也可延缓骨折愈合。

图 1 固定股骨所用外固定架(左)、截取后股骨(中)及骨折不愈合模型兔(右)

图 2 兔股骨截骨后从断端明显骨折线到骨折线模糊骨痂形成再到最后的骨性愈

图 3 兔骨折断端骨痂软组织观察

本实验的创新点在于选用兔股骨使用外固定方式造模。兔股骨最主要研究应用方向是以兔股骨头制作股骨头坏死模型，而以股骨作为研究骨折的部位较少。本研究以股骨为骨折造模部位，主要考虑股骨长度最长且骨皮质较厚，而且与胫腓骨共同作为兔的主要承重骨。尺桡骨及胫腓骨长度较短，外固定架螺钉之间距离无法掌握，而且因上述四个部位骨的皮质骨较薄，放置螺钉时较股骨更易劈裂。目前动物骨折实验的内固定方式主要有采用克氏针进行髓内固定、微型钢板进行内固定以及外固定架进行外固定三种。髓内固定和钢板内固定的抗旋转能力比较差，而实验动物无法制动，因此内固定可能会因实验动物自由活动产生的旋转力导致内固定失效，同时由于内固定的抗旋转能力差而导致骨折断端旋转微动造成局部血运受到破坏，使实验的干扰因素增多[15-17]。本研究采用外固定方式，外固定架的螺钉穿透股骨的层皮质，较内固定有更强的抗旋转力，同时也可牢固固定，因此对局部血运影响不大，而且只固定局部，不影响关节，实验动物可以自由活动。

本实验的不足之处: 1)骨折愈合影响因素有年龄、力学因素、局部血运是否丰富及内分泌等，同时临床上骨折有粉碎性、螺旋形、横行骨折等多种，本实验仅从兔股骨的横行骨折造模进行实验研究，力求在可控性应力与微动作用下证明该实验的客观性，为临床应用提供理论基础。但本实验仅从横行骨折造模进行实验过程，对轴向应力促进骨折愈合方面进行初步研究，尚不能作为临床治疗各种骨折的参考依据，需要从广度、深度上进一步研究。2)该实验的实验对象为新西兰白兔，虽然该实验达到了预期造模效果，但该模型的实验成果如需应用于临床治疗，因新西兰白兔与人存在物种差异, 需在伦理及临床允许下, 谨慎进行部分临床实验，取得显著成果后才可广泛用于临床治疗。

[1] 邢丹, 马信龙, 宋东辉, 等. 长骨骨折愈合力学环境的研究现状[J]. 生物医学工程与临床, 2012, 6(6):602-606.

[2] 李冀, 赵伟超, 关鹏飞, 等. 长骨医源性骨不连的临床流行病学调查[J]. 中国骨与关节损伤杂志, 2012, 27(1):34-36.

[3] Zhang M, Wang G, Zhang H, et al. Repair of segmental long bone defect in a rabbit radius nonunion model: comparison of cylindrical porous titanium and hydroxyapatite scaffolds. [J]. Artif Organs, 2014, 38(6):493-502.

[4] 郭树章, 季明华, 许刚,等. 兔骨折延迟愈合动物模型的建立[J]. 实用骨科杂志, 2012(3):230-232.

[5] Tawonsawatruk T, Kelly M, Simpson H. Evaluation of native mesenchymal stem cells from bone marrow and local tissue in an atrophic nonunion model[J]. Tissue Eng Part C Methods, 2013, 20(6):524-532.

[6] Wang L, Qin L, Cheung WH, et al. A delayed bone-tendon junction healing model established for potential treatment of related sports injuries[J]. Br J Sports Med, 2010, 44(2): 114-120.

[7] Kaipel M, Schützenberger S, Hofmann AT, et al. Evaluation of fibrin-based gene-activated matrices for BMP2/7 plasmid codelivery in a rat nonunion model[J]. Int Orthop, 2014, 38 (12):2607-2613.

[8] 吴孟超, 吴在德, 吴肇汉, 等. 外科学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2013:634-635.

[9] Hsu TL, Chiu FY, Chen CM, et al. Treatment of nonunion of humeral shaft fracture with dynamic compression plate and cancellous bone graft[J]. J Chin Med Assoc, 2005, 68(2):73-76.

[10] Zhang M, Wang G, Zhang H, et al. Repair of segmental long bone defect in a rabbit radius nonunion model: comparison of cylindrical porous titanium and hydroxyapatite scaffolds [J]. Artif Organs, 2014, 38(6):493-502.

[11] Roberto-Rodrigues M, Fernandes RMP, Senos R, et al. Novel rat model of nonunion fracture with vascular deficit[J]. Injury, 2015, 46(4):649-654.

[12] Nakamura A, Akahane M, Shigematsu H, et al. Cell sheet transplantation of cultured mesenchymal stem cells enhances bone formation in a rat nonunion model[J]. Bone, 2010, 46(2): 418-424.

[13] Brownlow HC, Simpson A. Metabolic activity of a new atrophic nonunion model in rabbits[J]. J Orthopaedic Res, 2000, 18(3):438-442.

[14] Eckardt H, Ding M, Lind M, et al. Recombinant human vascular endothelial growth factor enhances bone healing in an experimental nonunion model[J]. J Bone Joint Surg Br , 2005, 87(10):1434-1438.

[15] Mark H, Rydevik B. Torsional stiffness in healing fractures: influence of ossification: an experimental study in rats[J]. Acta Orthopaedica, 2005, 76(3):428-433.

[16] Sangkaew C. Distraction osteogenesis for the treatment of post traumatic complications using a conventional external fixator: a novel technique[J]. Injury, 2005, 36(1):185-193.

[17] Drosse I, Volkmer E, Seitz S, et al. Validation of a femoral critical size defect model for orthotopic evaluation of bone healing: a biomechanical, veterinary and trauma surgical perspective[J]. Tissue Eng Part C Methods, 2008, 14(1):79-88.

Establishment of Femoral Delayed Healing Model with External Fixation in Rabbit

KONG Qing-zhu1, ZHAO Jia lin2, FENG Zhen3
(Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, China)

Objective To establish a model of rabbit femoral delayed healing with the external fixation. Methods Seventy and two New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups, including the control group, the experimental group A and experimental group B. Make osteotomies of all the animals’ left femur, is in the middle, and make the micro adjustable external fixator as the fixtures. 10mm cortical bone has been removed of the experimental group A and group B while removing the inner and outer periosteum and bone marrow. Keep the experimental group A 1mm gap to the fracture site. The experimental group B has been using bone wax plugging the fracture site, while maintained contact with the fracture fragments. The control group cut off the cortical bone and then fixed with the external fixator, without removing the periosteum and bone marrow. Observe the healing of osteotomy by gross observation, radiographic and histological observation postoperatively. Results The healing time of the experimental group A and group B are 12 weeks, while the control group are four weeks. Conclusion The rabbit femur fracture delayed union model has X-ray and pathological features of delayed healing, indicating that the model is reasonable and reliable

Models; External fixator; New Zealand White Rabbits; Femur; Fractures; Delayed healing

Q95-33

A

1674-5817(2017)01-0059-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.06.013

2016-07-22

承德市科技支撑计划项目(201422036)

孔庆柱, 男、硕士, 主治医师。

E-mail: kongqingzhu0314@163.com

金 宇, 男、硕士, 主任医师。

E-mail: 792027135@qq.com