胡椒根提取物对大鼠骨关节炎模型的治疗作用

王 慧, 卓书洪, 高 雨

(海南省药物研究所, 海口 570314)

胡椒根提取物对大鼠骨关节炎模型的治疗作用

王 慧, 卓书洪, 高 雨

(海南省药物研究所, 海口 570314)

目的 对比研究胡椒根两种提取物对大鼠骨关节炎模型的治疗作用。方法 建立关节内注射木瓜蛋白酶诱发骨关节炎模型, 分别通过设立高、低剂量组、模型组及阳性对照组等多个组别, 研究造模4周中两种提取物各个剂量组对大鼠体质量、膝关节直径、关节腔表面状态、及血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α), 白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)的影响。结果 所有造模动物在实验2周时体质量增长较空白对照组有较大程度减轻(P＜0.05)。除醇提物低剂量组外, 膝关节直径变化量与模型组比较, 差异均具有统计学意义(P＜0.05)。在血清TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子测定中, 挥发油高剂量组、醇提物高剂量组与空白对照组比较, 差异不具有统计学意义(P＞0.05), 但醇提物高剂量组数值多显示出边缘显著现象(P接近0.05)。结论 胡椒根两种提取物在本次试验中所用剂量对骨关节炎模型均有一定程度改善作用, 但挥发油提取物高剂量组效果较好。

胡椒根提取物; 骨关节炎模型; 木瓜蛋白酶; 肿瘤坏死因子α(TNF-α）;

胡椒根为胡椒科攀援性藤本植物胡椒的根部，含有丰富的活性物质胡椒碱，此活性物质在镇痛、镇静、抗炎、抗惊厥等多方面具有一定的功效。研究表明[1]，胡椒根乙醇提取物口服给药具有显著的镇痛、抗炎、镇静及抗惊厥作用，胡椒根挥发油具有明显的抗炎、镇痛、镇静作用。临床数据亦证明[2], 胡椒根具有抗炎镇痛作用, 以胡椒根为主要原料药制成的制剂口服对软组织损伤等关节炎、骨损伤、坐骨神经痛等症具有一定的治疗功效[3]。

为充分研究胡椒根对骨关节炎的治疗作用，本实验通过对关节内注射木瓜蛋白酶诱发骨关节炎模型的药效学作用，对胡椒根治疗骨关节炎的功效做一综合评价。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠，45～55日龄，体质量200～ 250 g，购于广东省医学实验动物中心[SCXK(粤) 2013-0002]。饲养于海南省药物研究所内[SYXK(琼) 2014-0025]。动物饲料由长沙市天勤生物技术有限公司 [SCXK(湘)2014-0011)]提供, 自由饮食。

1.2 药品、试剂与仪器

吲哚美辛肠溶片, 25 mg/片, 广东华南药液集团有限公司生产, 批号20150107; 胡椒根醇提物及胡椒根挥发油, 海南省药物研究所自行提取; 肿瘤坏死因子α(TNF-α), 白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司, 产品编号分别为m1003549、m1002828、ml002859; L-半胱氨酸, 国药集团化学试剂有限公司, 批号20150210;木瓜蛋白酶, 东恒华道生物科技有限公司提供, 批号20150405。酶标仪(KHB-ST360, 上海科华仪器厂);离心机(DT5-2, 时代北利); 电子天平(AUW220D, 日本岛津公司)。脱水机(TP1020)、石蜡包埋机(EG1150H)、轮转式切片机(RM2245)和摊片机(HI1210,均为德莱卡公司); 立式显微镜(日本索尼公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 骨关节炎模型的建立 质量分数4%木瓜蛋白酶溶液与0.03 moL/L L-半胱氨酸按1∶1混合后静置0.5 h配制混合液备用。分别在实验1 d、4 d、7 d于大鼠右膝关节腔注射该混合液20 μL，4周后完成实验造模[4]。

1.3.2 实验分组及给药剂量 造模大鼠48只，雌雄各半, 将其随机分为模型组、阳性对照组(吲哚美辛肠溶片)及实验组(挥发油高、中剂量组, 醇提物高、中剂量组), 每组8只。挥发油高、低剂量组剂量分别为2.5 g/kg、1.3 g/kg, 醇提物、低剂量组剂量分别为 3.6 g/kg、1.8 g/kg。挥发油及醇提物剂量组的剂量设置来源于胡椒根挥发油及醇提物急性毒性试验中LD50的计算, 各提取物的高、低剂量组剂量分别为对应提取物的LD50的1/10、1/20。阳性对照组：将吲哚美辛肠溶片用蒸馏水溶解，按其说明书指示及实验动物与人按体表面积折算的等效剂量比值计算，给药剂量为0.016 g/kg(按人一日最大给药量150 mg)计。另取8只正常大鼠作为空白对照组。各组予以受试药物, 2 mL/只，每日一次，自造模后第一日起连续灌胃给药4周。模型组及空白对照组予以蒸馏水。

1.4 观察指标

1.4.1 动物状态及体质量变化 观察记录整个实验过程中动物的活动及死亡情况, 分别于实验前(0 d)、实验2周与实验4周(结束)测定大鼠的体质量，比较各组大鼠两个阶段给药后体质量增长的变化。体质量增长量=检测当日动物体质量-试验前(0 d)动物体质量。

1.4.2 大体观察 实验结束后处死全部动物，肉眼观察给药部位软骨及滑膜表面情况。

1.4.3 膝关节直径的测定[5]分别于试验前(0 d)与实验结束测定大鼠给药部位的膝关节直径，观察比较各组大鼠给药前后膝关节直径的变化，膝关节直径变化量=实验结束(4周)膝关节直径-试验前(0 d)膝关节直径。

1.4.4 生化指标测定[4]麻醉后大鼠下腔动脉取血,使用一次性人体静脉血样采集容器收集血液，分离血清，于-20 ℃保存。酶联免疫吸附测定法测定TNF-α、IL-1β、IL-6，水平。操作按照试剂盒操作说明要求进行。

1.4.5 病理学观察 大体观察结束后，各组随机取2～3只动物，打开关节腔后，取关节面软骨片，常规甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜下观察关节滑膜及软骨的情况。

1.5 统计学方法

采用SPSS22.0软件进行统计分析, Dunnett-t(方差齐)或Dunnett-T3(方差不齐)进行正态分布检验，检验各组差异性, 多组间比较进行单因素方差分析，所得数据以表示, P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物状态、体质量的影响

实验过程中，未见动物死亡，但在首次注射木瓜蛋白酶后2周内均出现不同程度的进食量变少、活动量减少的情况，实验最后两周有所缓解。实验结束时，造模大鼠注射关节部位出现一定程度的肿胀，造模的腿部部分动物出现严重瘸行等状态，但挥发油高剂量组及阳性对照组大鼠尚能正常站立，在笼内走动，饮食、活动状态优于其它的组别，模型组大鼠全体动物均出现瘸行状态。所有造模动物在实验初期始重与空白对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，实验2周时体质量增长明显低于空白对照组(P＜0.05)，实验后期体质量增长量逐渐恢复(表1)。

2.2 关节腔大体肉眼观察及病理学观察

动物麻醉处死后打开关节腔，肉眼观察可见空白对照组关节软骨表面光滑，透明，呈极淡蓝色; 模型组膝骨软骨无光泽，破坏较严重，部分软骨充血，出现局部糜烂，裂纹等症状; 阳性对照组、挥发油高剂量组、醇提物高剂量大部分软骨颜色淡白，部分关节软骨光滑，透明; 挥发油低剂量组、醇提物低剂量组软骨表面略粗糙，大多呈淡白至淡黄色，透明度较低。取部分切片进行病理学检查，光学显微镜下观察可见空白对照组大鼠关节结构完整, 软骨表面光滑(图1A), 模型组表面有纤维结缔组织增生，细胞排列无序，炎症细胞浸润(图1B); 阳性对照组软骨变薄, 接近正常关节组织(图1C); 挥发油高剂量组细胞纤维化，少量炎症细胞浸润(图1D); 挥发油低剂量组、醇提物高剂量组及低剂量组均出现纤维结缔组织增生，不等细胞排列无规则，炎症细胞浸润(图1E、图1F及图1G)。

表 1 胡椒根提取物对大鼠体质量的影响

2.3 提取物对膝关节直径的影响

实验显示，空白对照组实验前后膝关节直径无变化。各组造模大鼠给药部位的膝关节直径实验前后均有一定变化，除醇提物低剂量组外，膝关节直径变化量与模型组比较，差异均显著(P＜0.01);除挥发油高剂量组及醇提物高剂量组外，其他各组与阳性对照组比较，差异均显著(P＜0.01)(表2)。

2.4 提取物对关节炎致炎因子的影响

模型组TNF-α，IL-1β，IL-6含量均远超空白对照组(P＜0.01)(表3)。除醇提物低剂量组外，其他各组TNF-α与模型组比较，差异具有极显著意义(P＜0.01)，醇提物低剂量组数值显示出边缘显著现象(P=0.057); 醇提物低剂量组及模型组与阳性对照组比较，差异均显著(P＜0.01)。 挥发油高剂量组、醇提物高剂量组IL-β与空白组比较，差异不显著(P＞0.05), 但醇提物高剂量组数值亦显示出边缘显著现象(P=0.061); 各组与模型组比较, 差异显著(P＜0.01或P＜0.05); 醇提物低剂量组及模型组与阳性对照组比较，差异均显著(P＜0.01)。各组IL-6与模型组比较，差异均显著(P＜0.01或P＜0.05); 醇提物低剂量组及模型组与阳性对照组比较，差异均有显著(P＜0.01)(表3)。

图 1 大鼠关节软骨组织病理学观察(HE×100)

表 2 胡椒根提取物对大鼠膝关节直径的影响

3 讨论

目前用于诱导大鼠膝骨性关节炎(OA)的主要方式包括手术及化学药物注射法，其中膝关节腔注射药物被誉为建立OA动物模型的经典方法[6]，而注射木瓜蛋白酶为常见药物之一，模型成功率高，造模时间短，重复性好，且具有与人类骨关节炎类似的特点[7]。在本次实验方案中选用此模型，模型组发生了严重的炎症反应, 证明造模具有可靠性。

本试验结果表明，胡椒根提取物给药后期，与空白组比较，各给药组体质量增长基本恢复正常(P＞0.05)。在大体肉眼观察与病理观察中，各组均显示不同程度的软骨颜色变异、炎症细胞浸润等病变。与模型组比较，胡椒根两种提取物在按剂量给药后，均可不同程度地降低OA模型对大鼠体质量、膝关节直径及血清TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子的影响, 其中挥发油高剂量组、醇提物高剂量组在膝关节直径测定及血清TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子测定中，与阳性对照组比较，差异均不具有统计学意义(P＞0.05)，提示两种提取物在高剂量给药与阳性对照组比较，疗效相当。血清TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子测定中，与空白组比较，挥发油高剂量组差异均不具有统计学意义(P＞0.05), 而醇提物高剂量组在血清IL-1β、IL-6炎症因子测定，数值多显示出边缘显著现象(分别为P=0.061及P=0.048), 提示醇提物高剂量与空白组比较, 差异均有不确定性, 疗效与挥发油高剂量组具有一定的差异性。本项研究中, 两种提取物在降低大鼠OA动物模型膝关节直径及血清TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子方面具有一定剂量依赖关系，即高剂量优于低剂量, 且挥发油提取物疗效优于醇提取物。

表 3 胡椒根提取物对大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6表达的影响

本研究表明，胡椒根在高剂量使用上具有一定的抑制骨关节炎作用，因此，该植物药在抑制骨关节炎研究方面有可续持性研究意义。但本研究中提取物只选取了常用药效剂量(各提取物LD50的1/10及1/20)进行实验，提高剂量是否可以达到更佳治疗效果未进行探讨。另外，本次试验中动物模型样本数量偏少、治疗周期较短，两种提取物的剂量设置在疗效上的差异有待于进一步研究。

[1] 敖平, 李斌, 廖福龙, 等. 胡椒根乙醇提取物药理活性研究[J]. 中医药学报, 1998(3):61-62.

[2] 何思煌, 朱全红, 徐小燕. 胡椒根挥发油的中枢药理作用研究 [J]. 广东药学, 2003, 13(2):35-36.

[3] 李云燕, 张玉娥, 徐毅, 等. 半枫荷散治疗膝关节骨性关节炎50例疗效观察 [J]. 新中医, 2005, 37(7):17-18.

[4] 韦尼, 薛智丰, 陈自佳, 等. 补肾通络颗粒对膝骨关节炎大鼠血清细胞因子及关节软骨含水率的影响[J]. 风湿病与关节炎, 2015, 4(10):5-9.

[5] 黄永明, 潘建科, 郭达, 等. II型胶原蛋白酶诱导SD大鼠膝骨关节炎模型的建立 [J]. 广东医学,2015,36(8):1145-1148.

[6] 张立, 王培民. 膝骨关节炎动物模型的选择 [J]. 世界中西医结合杂志, 2014, 9(7):782-786.

[7] 邓宇, 伍筱梅, 任医民, 等. 关节腔内注射不同蛋白酶建立兔膝骨关节炎模型的对比研究[J]. 中华关节外科杂志, 2009, 3(3):332-339.

Q95-33

B

1674-5817(2017)01-0064-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.01.014

2016-07-08

海南省自然科学基金(20158302)

王 慧(1984-), 女, 助理研究员, 研究方向: 药理学。42321346@qq.com

白细胞介素1β(IL-1β）; 白细胞介素6(IL-6)