侧脑室注射神经节苷脂钠对脑瘫模型大鼠学习记忆能力的影响

杨凤翔, 张小乔, 罗秀玲

(十堰市太和医院神经康复中心, 十堰 442000)

侧脑室注射神经节苷脂钠对脑瘫模型大鼠学习记忆能力的影响

杨凤翔, 张小乔, 罗秀玲

(十堰市太和医院神经康复中心, 十堰 442000)

目的 探讨神经节苷脂钠(GM)侧脑室注射对脑瘫模型大鼠学习记忆能力的机制，为临床治疗脑瘫提供理论依据。方法 将36只SPF级SD大鼠随机分为对照组、模型组和GM组。模型组和GM组大鼠通过切除大脑皮质及部分脑组织建模。成模后1 d、10 d、20 d、30 d用大鼠脑定位仪经大鼠侧脑室注射GM给药。在成模后和未次给药后用水迷宫仪进行空间探索实验、定位航行、悬吊、斜坡等实验，比较大鼠学习记忆能力及运动能力改变，并采用ELISA测定脑海马区乙酰胆碱 (Ach)及眶静脉血乙酰胆碱脂酶(AChE)活性; 脑组织液钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II(CaMKII)及钙调蛋白(CaM)。结果 与模型组比较, GM组大鼠治疗后找到平台时间及斜坡实验时间显著缩短; 悬吊时间、第一象限和中环停留时间明显延长; 定位航行中潜伏期、游泳距离缩短, 脑海马区Ach含量降低、AChE活性增强; 脑组织液CaMK II及CaM 增高(P＜0.05)。结论 GM可明显抑制脑瘫模型大鼠脑组织液CaMK II和CaM合成, 降低神经细胞钙蛋白水解和钙内流, 并通过阻断CaMK II这一信号传导通路, 提高AChE活性, 抑制Ach释放来降低大鼠因脑缺血缺氧对中枢神经造成的损伤, 使受损脑神经纤维修复和再生, 进而促进中枢神经纤维功能恢复来提高学习记忆能力。

神经节苷脂钠(GM); 乙酰胆碱(Ach); 钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II(CaMKII);

脑性瘫痪又称脑瘫，产伤窒息、缺血缺氧性脑病、早产、低体质量及脊髓灰质炎病毒感染等均是造成脑瘫的主要病因[1]。脑瘫患儿智力发育不良，并多伴随持续存在的躯体运动或中枢性运动障碍性症候群等临床症状[2]。神经节苷脂钠(GM)通过维持细胞内外钙离子平衡、稳定神经细胞膜通透性保护神经细胞[3]。有研究表明[4]，乙酰胆碱(Ach)过量释放会引起神经元癫痫样放电和突触后神经元坏死。通过参与调节脑组织中神经递质Ach合成与释放、提高乙酰胆碱脂酶(AChE)可减轻Ach对神经元的神经毒性，促进神经细胞修复而减轻脑损伤，提高学习与认知功能[5]。本实验中，作者采用国内外公认的行为学检测方法作为鉴定脑瘫模型的成模标准[6]，经侧脑室注射GM给药后，用Morris 水迷宫等实验来观察其学习记忆功能改变，并检测大鼠脑组织中Ach和AChE活性、脑组织液钙调蛋白依赖性蛋白激酶 Ⅱ(CaMKII)及钙调蛋白(CaM)含量，试图分析GM治疗脑瘫作用机制，为临床治疗脑瘫提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级雄性SD大鼠36只，体质量180～210 g，由十堰市太和医院动物中心提供 [SCXK(鄂)2011-0008] ，将动物随机分为对照组、模型组和GM组。动物实验在本院科技中心动物实验室完成[SYXK(鄂)2011-0031]。

1.2 实验仪器与药品

WMT-100型Morris水迷宫视频跟踪分析系统(成都泰盟软件有限公司成都泰盟软件有限公司); 51600 U高精度标准脑立体定位仪(上海玉研科学仪器有限公司); GM(北京赛升药业股份有限公司，批号20093980); 戊巴比妥钠(北京普博斯生物科技有限公司，批号: P3761)。

1.3 大鼠脑瘫模型制备方法

参照文献[7]方法，造模前动物禁食12 h，不禁水，用质量分数3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉后俯卧位固定于51600 U高精度标准脑立体定位仪，剪去头顶被毛，碘伏消毒后用体积分数75%乙醇脱碘，铺无菌巾。造模时切开大鼠颅顶正中皮肤，刮去骨膜暴露矢状缝，用骨钻在矢状缝左侧0.2 cm处钻孔开窗，切开大鼠硬脑膜暴露大脑皮质，沿颅骨窗边缘切开大脑皮质，切除部分大脑髓质和皮质，然后用骨水泥修补骨窗，清创缝合并用碘伏消毒，一般在术后7 d建成脑瘫模型[8]。对照组骨钻开窗后不剥离大脑髓质和大脑皮质，等待10 min后，用骨水泥修补骨窗，清创缝合并用碘伏消毒。

1.4 治疗方法

成模后1 d、10 d、20 d及30 d，戊巴比妥钠麻醉大鼠，用51600 U高精度标准脑立体定位仪固定。GM组用微量注射器经大鼠侧脑室注射GM给药, 用量: 20 μL/次，每10 d注射1次, 共3次。对照组和模型组注等体积生理盐水。

1.5 观察指标

于未次给药后10 d, 用斜坡和悬吊实验测试运动功能[9]。运动功能测试完成后将大鼠放入 Morris水迷宫中观察脑瘫大鼠的学习记忆能力[10]。并在第一次和未次给药后10 d，分别处死6只大鼠，抽取5 μL脑组织液用以检测CaM及CaMKII，剥取脑海马区，用ELISA法检测海马区Ach含量，抽取眶静脉血检测AChE活性。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠脑海马区Ach和AChE

对照组脑海马区Ach和AChE治疗前后无明显差异。与对照组比较，模型组AChE降低、Ach升高(P＜0.05)。与模型组同组治疗前比较，GM组大鼠治疗后Ach降低、AChE升高(P＜0.05)，但GM组大鼠治疗后Ach和AChE未完全恢复至对照组水平(P＜0.05)(表1)。

2.2 大鼠脑组织液CaMKII和CaM

对照组脑组织液CaMKII和CaM治疗前后无明显差异。与对照组比较，模型组CaMKII和CaM降低(P＜0.05)。与模型组及同组治疗前比较, GM组大鼠治疗后CaMKII和CaM降低(P＜0.05)(表 2)。

2.3 大鼠运动功能

在斜坡实验中，对照组大鼠反应敏捷，滑落底部时会掉头向上，用时很短；悬吊实验中，大鼠悬吊运动灵活准确、悬吊时间长。与对照组比较，模型组大鼠斜坡实验中掉头用时延长、其反应迟缓、滑落底部时不能及时掉头向上(P＜0.05);悬吊实验中很快滑落、其悬吊时间缩短，肢体肌力、灵活性和稳定性明显降低(P＜0.05)。与模型组比较，GM组大鼠肢体肌力、灵活性和稳定性明显好转，掉头向上时间明显缩短、悬吊时间明显延长(P＜0.05)，但GM组大鼠治疗后悬吊实验和斜坡实验未完全恢复到对照组水平(P＜0.05)(表3)。

表 1 治疗前后3组大鼠脑海马区Ach和静脉血AChE比较

表 2 治疗前后3组大鼠CaMKII和CaM比较

2.4 大鼠学习能力实验

在Morris水迷宫空间探索实验中，与对照组比较, 模型组学习找平台时间明显延长, 第一、二象限停留时间明显降低，中环停留时间长于内环和外环(P＜0.05)。与模型组比较, GM组大鼠学习找平台时间明显缩短，第一象限和中环停留时间明显延长(P＜0.05)，但均未达对照组水平(P＜0.05)(表4)。

2.5 大鼠定位航行实验

与对照组比较，模型组定位航行潜伏期和游泳距离明显延长(P＜0.05)。与模型组比较，GM组大鼠潜伏期和游泳距离明显缩短(P＜0.05)，但游泳距离未达对照组水平(P＜0.05(表5)。

表 3 治疗后3组大鼠悬吊实验和斜坡实验比较

表 4 治疗后3组大鼠Morris水迷宫空间探索比较

表 5 大鼠定位航行比较

3 讨论

GM是从猪脑中提取的具有保护受损神经细胞的物质, 即单唾液酸四己糖神经节苷脂钠(GM)，能促进受损中枢神经系统功能恢复。研究表明[12]，GM可以与神经细胞膜结合，改善细胞膜酶的活性，减轻神经细胞水肿，促进“神经重构” (包括神经细胞的生存、轴突生长和突触生长)。GM作为神经营养因子的增强剂，可通过调节细胞膜Ca2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活性，稳定神经细胞膜的结构和功能，并促进受损神经细胞能量代谢神经中枢系统起到对受损神经细胞的保护作用[13]。临床上常用于治疗脑性瘫痪、脊髓损伤、脑梗死、新生儿缺氧缺血性脑病、脑萎缩、脑出血等颅脑损伤性疾病[14]。

本实验中，GM组经3次侧脑室注射GM给药后，脑海马区Ach含量降低、AChE活性增强; 脑组织液CaMKⅡ及CaM 增高。以上结果提示侧脑室注射GM给药治疗脑瘫有效，脑瘫大鼠学习记忆能力提高。研究表明[15]，Ach是中枢胆碱能神经的重要神经递质之一，Ach广泛分布于乙酰胆碱能神经末梢，尤以脑干、丘脑、海马-杏仁核等为多，Ach与运动、学习、记忆和认知等有密切相关。而AChE是水解Ach酶，AChE降低会影响AChE是水解，造成Ach在神经突触蓄积中毒[16]。脑瘫导致神经损伤后，AChE活性降低、Ach大量蓄积神经突触而加重神经损伤，使学习和记忆能力降低[17,18]。本实验中观察到GM组脑海马区Ach含量降低、AChE活性增强，说明GM可能通过抑制中枢胆碱能神经释Ach，提高AChE活性来水解Ach，减少神经突触Ach蓄积来降低神经损伤。实验还观察到GM组脑组织液中CaMKII和CaM降低，这可能是GM阻断了脑瘫大鼠中枢神经系统兴奋性氨基酸对神经元的毒性作用，选择性抑制谷氨酸过度激活引起的中枢神经病理改变[19]。在电生理方面，细胞内钙超载会直接造成中枢神经细胞受损，而Ca2+作为胞浆内第二信使，可与CaM形成Ca2+-CaM复合物，这种复合物可进一步激活CaMKII，并使CaMKII酶的构象发生改变，Ca2+大量内流而加重钙超载[20]。GM可能在这一环节起到抑制Ca2+内流来减轻或防止钙超载对中枢神经细胞损伤。另外，GM也有可能通过调节细胞膜Na+-K+-ATP和Ca2+-ATP活性，稳定神经细胞膜的结构和功能来达到保护神经功能的作用，但这一点需要用膜片钳实验来证实。此外，外源性GM能与神经细胞膜结合，促进神经生长因子生长，对受损神经元具有修复再生作用[21]。有研究表明[22,23]，增加脑海马区ACh含量可明显缩短实验动物的正确反射恢复时间，改善水迷宫学习和认知能力。本实验也证实，GM组水迷宫认知能力明显提高，大鼠找到平台时间及斜坡实验时间显著缩短, 悬吊时间、第一象限和中环停留时间明显延长, 定位航行中潜伏期、游泳距离缩短。这与GM抑制中枢胆碱能神经释Ach, 提高AChE活性来水解Ach, 降低CaMKII和CaM, 阻断Ca2+/CaM-CaMKⅡ信号传导通路引起的钙超载, 促进受损神经再生及功能的恢复有关。

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Effect of Lateral Ventricle Injection of Ganglioside Sodium on Learning and Memory in Rats with Cerebral Palsy

YANG Feng-xiang, ZHANG Xiao-qiao, LUO Xiu-ling
(Department of Nerve rehabilitation Center, Taihe Hospital, Shiyan 442000, China)

Objective To study the mechanism of Ganglioside (GM) lateral ventricle injection on learning and memory ability of rats with cerebral palsy, and to provide theoretical basis for clinical treatment of cerebral palsy. Methods Thirty-six SPF rats were randomly divided into blank control group, model group and GM group. The model group and GM group were randomly divided into the model group and the SD group. After modeling, 1 days and 10, 20, 30 days with the brain localization of rat instrument by rat intracerebroventricular injection of GM administered after modeling and administration after the water maze experiment instrument to explore, navigation, suspension and slope experiments comparing the ability of learning and memory of rats and exercise the ability to change space. And using the ELISA method for the determination of acetylcholine in hippocampus (Ach) and orbital venous blood acetylcholinesterase (AChE) activity. Determination of brain tissue and calmodulin dependent protein kinase II (CaMKII) and calmodulin (CaM). Results Compared with the model group, the rats in group GM after treatment, the time of finding the platform and slope experiment time was significantly shortened, suspension time, the first quadrant and the residence time in the voyage prolonged; positioning latency, swimming distance shortened, the Ach level was decreased, and AChE activity was increased. the brain tissue of liquid CaMK and CaM increased (P＜0.05). Conclusion In rat cerebral palsy model, GM could inhibit the synthesis of CaMKII and CaM, reduce hydrolysis of neuronal calcium protein and calcium influx. By blocking the signaling pathway of CaMKII, GM treatment increases the activity of Ach, reduces brain damage caused by cerebral ischemia and hypoxia, thus promoting repair and regeneration of lesioned nerves and subsequently learning and memory.

Ganglioside sodium; Acetylcholine; Calmodulin dependent protein kinase II(CaMKII); Calmodulin(CaM); Space exploration experiment; Learning and memory

Q95-33

A

1674-5817(2017)01-0015-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.01.004

2016-08-26

湖北省教育厅项目(D20152101, 2013Z-B13)

杨凤翔(1973-), 女, 副主任护师, 从事骨科康复医学研究。E-mail: fengyanqin163163@126.com

张小乔(1962-), 男, 神经学博士, 主任医师, 从事临床老年神经系统疾病康复医学研究。

E-mail: fengyanqin163163@126.com

钙调蛋白(CaM); 空间探索实验; 学习记忆能力