大鼠细小病毒双重PCR检测方法的建立

饶 丹, 朱余军, 伍妙梨, 袁文, 王 静, 尹雪琴, 丛 锋, 练月晓,黄碧洪, 徐凤娇, 刘向楠, 刘助红, 黄 韧, 张 钰, 郭鹏举

(广东省实验动物监测所, 广州 510663)

大鼠细小病毒双重PCR检测方法的建立

饶 丹, 朱余军, 伍妙梨, 袁文, 王 静, 尹雪琴, 丛 锋, 练月晓,黄碧洪, 徐凤娇, 刘向楠, 刘助红, 黄 韧, 张 钰, 郭鹏举

(广东省实验动物监测所, 广州 510663)

目的 建立快速检测大鼠细小病毒的PCR方法。方法 根据大鼠细小病毒基因序列的特点，建立鉴别检测大鼠细小病毒(RPV)与其他三种大鼠细小病毒(H-1、KRV、 RMV)的双重PCR方法。根据RPV核酸序列的性质，在VP2基因筛选了一对用于特异扩增RPV株的引物，在NS1基因设计了一对用于特异性扩增H-1、KRV和RMV的引物。结果 两对引物组成的二重PCR方法可以特异性的扩增RPV而不扩增核酸同源性高的小鼠细小病毒和多种其他病原微生物；敏感性实验表明，二重PCR的最低检测限可达1 000 拷贝/μL。双重PCR结合测序在检测23份临床样本中，检测出7份RMV阳性，包括1份与RPV共感染阳性样本。结论 本研究建立的检测RPV的双重PCR方法具有特异性好、灵敏度高及操作简单等优点，是一种简便、可靠的检测方法。

大鼠细小病毒(RPV); H-1; KRV; RMV; 双重PCR

大鼠细小病毒是一类广泛存在于大鼠群中的病毒，属于细小病毒科，细小病毒属，为一类无包膜的小DNA病毒。H-1(Toolan virus-1)株和KRV (Kilham Rat Virus)株是1950年代末期因感染大鼠中传代的肿瘤细胞系而被发现，后续又在自然感染大鼠中发现了RPV(rat parvovirus)株和RMV(rat minute virus)株[1,2]。通常情况下，自然感染细小病毒的成年大鼠无临床体征表现; 临床观察到只有少数几例KRV 自然感染的情况但还未发现H-1株自然感染的病例[3]。自然感染KRV株的大鼠可出现胎儿被母体吸收和胎儿小脑发育不全、乳鼠黄疸及幼鼠脱水等症状。H-1、RMV和RPV株感染大鼠后临床症状不明显，但也可在鼠群中造成持续性感染。在野生大鼠中大鼠细小病毒有较高的感染率较高，被感染鼠可通过粪便长期向外排毒，污染饲料、饮水和周围环境，细小病毒在鼠群中持续存在对动物实验研究结果造成干扰甚至严重影响[4]。

由于RPV株与其他3种大鼠细小病毒株及其他啮齿动物细小病毒核酸同源性差异大[1]，建立一种检测四种大鼠细小病毒株而不检测其他啮齿动物细小病毒株的单重PCR方法比较困难，这也给一次性筛查大鼠细小病毒株带来不便。

本文建立了检测4种大鼠细小病毒株的双重PCR方法，并经特异性、敏感性及临床样品检测。

1 材料与方法

1.1 试剂

核酸提取试剂盒为DNA/RNA共抽提试剂盒(天根)，PCR反应酶试剂、pMD-19T载体等试剂为TAKARA相关产品(大连宝生物)。

1.2 样本的收集

大鼠细小毒株H-1, KRV来自于ATCC, RMV、RPV及其他病原株为本实验室保存株。

病毒细胞培养物及临床野生鼠样本，用于试验方法的验证。

1.3 引物的设计

NCBI下载大鼠细小的所有全基因序列及小鼠、猪等细小病毒序列，比对全基因序列筛选扩增RPV株的特异引物及同时扩增H-1，KRV和RMV的引物。其中P1/P2引物用于扩增大鼠细小病毒RPV株，P3/P4引物用于扩增H-1，KRV和RMV株(表1)。

1.4 病毒DNA的提取

采用天根DNA/RNA提取试剂盒提取样品中的大鼠细小病毒DNA，样品包括组织脏器、粪便或细胞培养物。以从ATCC获取的H-1、KRV株，本实验室分离保存的RMV、RPV为阳性对照，以小鼠细小病毒MVM株、多瘤病毒(Poly)、肝螺杆菌、鼠伤寒沙门氏菌为样本阴性对照，及水为空白对照。

表 1 双重PCR引物Table 1 Primers of double PCR

1.5 PCR反应

采用Takara Premix Ex-Taq预混酶为PCR反应酶试剂, 反应总体积为20 μL, 内含Premix Ex-Taq 10 μL、引物P1/P2(各0.5 μL, 终浓度均为0.25 μmoL/L)、引物P3/P4(各0.5 μL, 终浓度为0.25 μmoL/L), DNA模板2 μL，双重蒸馏水 6 μL。

PCR扩增反应程序为: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s; 循环35 次; 72 ℃终延伸5 min。

1.6 敏感性分析

分别将各毒株扩增的基因片段插入PMD-19T载体中，将质粒从1×107拷贝/μL稀释至1×101拷贝/μL，以各稀释质粒为模板进行PCR扩增。

1.7 扩增反应分析

PCR产物以上样量5 μL点样于1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外透射仪下观察扩增条带。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

图1为阳性对照样品与其他病原微生物在引物P1/P2, P3/P4下扩增的PCR产物电泳图。混合模板能够清晰的扩增出RPV与RMV 目的条带而无非特异性扩增。与大鼠细小病毒核酸同源性高的小鼠细小病毒MVM株以及其他病原微生物无扩增片段。

图 1 双重PCR检测电泳图Figure 1 Electrophoresis of dual PCR

2.2 PCR敏感性

为了能够定量分析研究方法中引物的扩增效率，构建4种毒株基因片段的质粒。敏感性分析结果(图2～4)表明，以单模板RMV基因片段构建的质粒在二重引物PCR扩增下检测至少可达质粒稀释的最大倍数的浓度10拷贝/μL，以单模板RPV基因片段构建的质粒在双重引物扩增下的敏感性可达100拷贝/μL，以RPV和RMV混合模板在双重引物扩增下的最低检测浓度为1 000拷贝/μL。

2.3 临床样本检测

图 2 RMV单模板敏感性分析Figure 2 Sensitivity analysis of RMV single template

图 3 RPV单模板敏感性分析Figure 3 Sensitivity analysis of RPV single template

图 4 双重PCR敏感性分析Figure 4 Sensitivity analysis of dual PCR

表 2 临床样本检测结果Table 2 Detection of clinical sample

抽取野鼠样本23份肝、脾组织混合样品用于检测验证，样本按照试剂盒说明抽提样本总DNA/ RNA。检测结果(表2)显示: 除一份共感染的样本外，其他多份样本的PCR扩增条带大小为226 bp，说明存在H-1、KRV和RMV株的其中一种或几种，通过其他PCR验证及测序分析，表明细小病毒株为RMV株，未检测到H-1和KRV株。与RMV和RPV株在鼠群中感染率比较高的相关报道一致[5]。

3 讨论

大鼠细小病毒是大鼠感染中比较常见的病毒，自然感染的大鼠通常无临床症状。PCR 方法已经用于啮齿动物细小病毒的检测[4,6,7]，但还没有一种用于检测包括4种大鼠细小病毒株在内的PCR方法。本研究建立了一种可用于检测包含4种大鼠细小病毒在内的双重PCR方法，一对特异性引物扩增RPV株的VP2基因片段，另一对引物扩增另外3种大鼠细小株(H-1、KRV和RMV)的NS1基因序列。两对物扩增的片段大小差为91 bp，便于凝胶电泳图中对目的条带的识别，同时因扩增片段大小差别适中对相互的扩增效率影响小。建立的方法通过特异性验证，对于多种其他病原微生物无特异性扩增片段及可见杂带，阳性样本可获得清晰的目的扩增片段并且无非特异性扩增。敏感性试验中，单模板最低检测限度分别可达10及100拷贝/μL，混合模板的最低检测限度均可达1 000 拷贝/μL，可见两对引物的扩增效率高，可作为可靠的检测用引物。本研究建立的大鼠细小病毒双重PCR方法对筛查大鼠细小病毒的感染具有一定的应用价值。

[1] Besselsen DG, Besch-Williford CL, Pintel DJ, et al. Detection of H-1 parvovirus and Kilham rat virus by PCR[J]. J Clin Microbiol, 1995, 33(7):1699-1703.

[2] 贺争鸣, 卫礼, 张然, 等. 检测大鼠细小病毒抗体的ELISA、IEA和HI法比较[J]. 上海实验动物科学, 1993, 13(3):132-134.

[3] 刘先菊, 佟魏, 张丽芳, 等. 大鼠细小病毒H-1株培养方法的建立[J]. 中国实验动物学报, 2011, 19(6):495-498.

[4] Ball-Goodrich LJ, Leland SE, Johnson EA, et al. Rat parvovirus type 1: the prototype for a new rodent parvovirus serogroup [J]. J Virol, 1998, 72(4):3289-3299.

[5] Wan CH, Soderlund-Venermo M, Pintel DJ, et al. Molecular characterization of three newly recognized rat parvoviruses [J]. J Gen Virol, 2002, 83(8):2075-2083.

[6] Wan CH, Bauer BA, Pintel DJ, et al. Detection of rat parvovirus type 1 and rat minute virus type 1 by polymerase chain reaction[J]. Lab Anim, 2006, 40(1):63-69.

[7] 李晓波, 付瑞, 王吉, 等. 大鼠细小病毒 H-1 株和KRV株双重PCR检测方法的建立及应用[J]. 中国比较医学杂志, 2015, 25(6):46-52.

Development of Dual PCR for Detection of Rat Parvovirus

RAO Dan, ZHU Yu-jun, WU Miao-li, YUAN Wen, WANG Jing, YIN Xue-qin, CONG Feng, LIAN Yue-xiao, HUANG Bi-hong, XU Feng-jiao, LIU Xiang-nan, LIU Zhu-hong, HUANG Ren, ZHANG Yu, GUO Peng-ju

Objective To establish a PCR method for rapidly detecting rat parvovirus. Methods According to the characters of nucleotide sequence of rat parvovirus, a dual PCR was developed to differentially detect RPV and other three rat parvovirus (H-1/KRV/RMV). A pair of primers amplifying VP2 gene were applied to exclusively amplify RPV while another pair of primers targeting the NS1 gene was designed for specific amplification of H-1, KRV and RMV primer. Result Rat parvovirus were screened without detecting minute virus of mice which had high nucleotide homology with rat parvovirus and also negative for three other microorganism pathogen. Sensitivity tests showed that the minimum detectable concentration was as low as 1 000 copies μL. When dual PCR combined with sequencing were applied to detect 23 clinical samples, seven samples detected were RMV positive including one coinfected with RPV. Conclusion The dual PCR was verified to be specific and sensitive which could be used as a reliable method to screen rat parvovirus.

Rat Parvovirus (RPV); H-1; KRV; RMV; Dual PCR

S855.3 Q95-33

A

1674-5817(2017)01-0032-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.01.007

2016-09-05

广东省科技计划项目(2014B070706006); 国家科技支撑计划(2015BAI07B00)广东省科技计划项目(2013B060400028)

饶 丹(1988-), 研究实习员, 研究方向: 临床应用分子生物学。 E-mail: raodan2007@126.com

郭鹏举(1970-), 研究员, 研究方向: 兽医免疫学。E-mail: PIGuo2016@163.com