胆碱能抗炎通路对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响

王 潇 苏 跃 李天佐 赵斌江

(首都医科大学附属北京世纪坛医院麻醉科, 北京 100038)

· 麻醉学与神经科学 ·

胆碱能抗炎通路对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响

王 潇 苏 跃 李天佐 赵斌江*

(首都医科大学附属北京世纪坛医院麻醉科, 北京 100038)

目的 本研究应用不同的胆碱能受体干扰剂M1受体激动剂McN-A-343(MA343)、M2受体拮抗剂美索曲明(methoctramine，MET)以及α7亚单位的N型受体激动剂胆碱(choline, CHO)分别作用于胆碱能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway, CAP)，通过检测不同部位肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)浓度，进一步探讨CAP对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响。方法 健康成年雄性SD大鼠25只，采用数字表法随机分为5组(n=5)：假手术组(sham operation group, Sham)、脑缺血再灌注组(ischemia reperfusion group, I/R)、MET组、MA343组和CHO组。四血管结扎法(four-vessel occlusion，4-VO)建立全脑缺血再灌注损伤模型，电凝大鼠双侧椎动脉(Sham组除外)，于缺血前15 min分别经侧脑室向MET组、MA343组及CHO组注射MET、MA343及CHO，Sham组及I/R组注射0.9%(质量分数)氯化钠注射液10μL。除Sham组外，各组夹闭双侧颈总动脉20 min后再灌注。再灌注6 h后，断头处死动物，采集标本。放射免疫法(radio-immunoassay, RIA)检测左侧海马、心、肝、肺、肾和血浆中TNF-α、IL-1β浓度。TdT介导的dUTP缺口末端标记技术染色(terminal deoxynucleotidyl-trallsferase meiated dUTP nick end labeling, TUNEL)检测右侧海马CA1区细胞凋亡数。结果 再灌注后，MET组和MA343组海马、心、肝、肾组织匀浆及血浆TNF-α、IL-1β浓度显著低于I/R组(P<0.05)。CHO组海马TNF-α浓度较I/R组有所降低(P<0.05)，而心、肝、肾及血浆TNF-α、IL-1β浓度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。MET、MA343和CHO均未能降低肺组织TNF-α、IL-1β浓度。与I/R组相比，MET、MA343及CHO组海马CA1区凋亡细胞数目减少(P<0.05)。结论 TNF-α、IL-1β的释放是脑缺血再灌注损伤的重要机制之一，CAP对脑缺血再灌注引发的局部及全身炎性反应均具有保护作用。其机制与MET、MA343和CHO抑制缺血再灌注后TNF-α、IL-1β的合成与释放有关。

胆碱能抗炎通路；迷走神经；脑缺血再灌注；肿瘤坏死因子-α；白介素-1β；美索曲明；McN-A-343；胆碱

与缺血再灌注有关的急性炎性反应促进了继发性脑损害的发展[1]。在脑缺血过程中，中枢神经系统(central nervous system，CNS)分泌的肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)等构成了缺血性损伤向炎性反应性损伤转变的基础，随后白细胞向缺血区聚集导致微血管再闭塞，引发“无复流”现象[2]。目前针对脑缺血再灌注损伤的治疗主要为药物性脑保护，其中许多药物尚处于动物实验阶段，临床效果尚有待证实。

新近研究[2-6]显示胆碱能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP)也许能为治疗脑缺血再灌注的炎性反应损伤提供新的思路。CAP是一条神经-免疫调节通路，它通过迷走神经及其递质乙酰胆碱与免疫系统相互作用，参与抗炎性反应。

本实验建立大鼠短暂性全脑缺血再灌注模型，探讨CAP对大脑局部和继发全身炎性反应的影响，为脑缺血再灌注损伤提供新的治疗方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠25只，清洁级，体质量280～320 g。动物分笼饲养，每笼5只，自由饮食，饮自来水，标准颗粒饲料，室温18～22 ℃。动物及饲料由北京结核病胸部肿瘤研究所动物实验室，实验动物许可证号：SCXK(京)2006-0008。

1.2 动物分组及给药方法

SD大鼠采用数字表法随机分为5组：①假手术组(Sham组)；②脑缺血再灌注(ischemia reperfusion group, I/R组)；③美索曲明组(methoctramine，MET组)：注射剂量为500 ng/kg；④McN-A-343组(MA343组)：注射剂量为500 ng/kg；⑤胆碱组(choline, CHO组)：注射剂量为500 ng/kg。术前将药物用0.9%(质量分数)氯化钠注射液配制成10 μL溶液，Sham组及I/R组注射等剂量0.9%(质量分数)氯化钠注射液。

1.3 四血管结扎法(four-vessel occlusion，4-VO)法全脑缺血再灌注损伤模型的制备及侧脑室注药

水合氯醛腹腔注射麻醉，将大鼠固定在立体定位仪上，直视下闭塞双侧椎动脉。仰卧位固定，暴露双侧颈总动脉，置4-0号丝线备用。置笼喂养，自由饮食。假手术组仅暴露双侧颈椎翼小孔。

4 h后经异氟烷麻醉，微量进样器自脑表面垂直进针3.5 mm，回抽有清亮脑脊液后，将药物3 min注射完毕。留针5 min。Sham组及I/R组注入10μL 0.9%(质量分数)氯化钠注射液。手术过程及术后保持肛温37 ℃。15 min后，清醒状态下固定大鼠，提起分离的颈总动脉，用无创性小动脉夹夹闭，造成全脑缺血。缺血20 min，松开动脉夹实现再灌注，回笼饲养，自由饮食饮水，再灌注6 h。Sham组仅暴露双侧颈总动脉，不做夹闭手术。

模型成功的标准：大鼠在30～60 s内昏迷，翻正反射消失，双侧瞳孔放大，双眼底变白，痛反射消失，但角膜反射存在，能自主呼吸。

1.4 标本提取

6 h后麻醉下断头取脑，冰盘取双侧海马，迅速入液氮保存。取左肺下叶、心尖部、肝左叶下缘、左肾下缘组织标本，冰冷0.9%(质量分数)氯化钠注射液冲洗，-70 ℃保存。

左侧海马50 mg置于冰浴的50 mmol/L醋酸缓冲液(pH=4.75)匀浆器中，用2 mL无水乙醇洗匀浆器，静置5 min，离心，收集上清液，再用75%(体积分数)乙醇1 mL洗匀浆器连续2次，洗沉淀，混匀，离心后取上清-70 ℃保存，待测。心、肺、肝、肾组织的处理方法与上述相同。

右侧海马常规上行脱水、二甲苯固定后用石蜡包埋，连续切片，切片厚4 μm，每隔10张取1张，每个取4张。在60 ℃的温水中充分展开，玻片贴片，备用。

取1.0 mL血清，加入10 μL抑肽酶，摇匀，-20 ℃保存。

1.5 观察指标

放射免疫法测定组织 TNF-α、IL-1β的浓度；测定血清TNF-α、IL-1β的浓度；原位细胞凋亡检测(TUNEL法)。

1.6 图像分析

采用Motic MC Camera 1.1软件对切片进行图像分析。光学显微镜200高倍镜视野下，对海马区域中随机取8个非重叠的视野，进行观察并对阳性细胞进行计数分析，阳性细胞镜下呈棕黄色，圆形或椭圆形致密块。计算凋亡细胞百分率[凋亡细胞百分率=阳性细胞数/(阳性细胞阴性细胞数)×100%][4]。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 组织和血浆中TNF-α浓度变化

I/R组海马、心、肺、肝、肾组织匀浆和血浆中TNF-α浓度均显著高于Sham组(肾匀浆P<0.05，海马、心、肺、肝和血浆P<0.01)。MET组及MA343组海马、心、肝、肾组织匀浆和血浆中TNF-α浓度均显著低于I/R组(肾匀浆P<0.05，海马、心、肝和血浆P<0.01)。CHO组与I/R组相比，除海马匀浆中TNF-α的减少差异有统计学意义(P<0.01)外，其余各组织及血浆TNF-α变化差异无统计学意义(P>0.05)。与I/R组相比，MET组、MA343组及CHO组中肺组织匀浆中TNF-α的浓度减少差异均无统计学意义(P>0.05)(表1，图1)。

在I/R组中，与海马相比，心、肺、肝、肾组织匀浆及血浆TNF-α浓度差异有统计学意义(均P<0.01)，各组织间及血浆之间的差异具有统计学意义(P<0.05)，其TNF-α浓度高低依次为海马>血浆>肺>肝>心>肾(表1)。

表1 左海马、心、肺、肝、肾组织匀浆和血浆中TNF-α浓度变化Tab.1 Left hippocampus, heart, lungs, liver, kidney tissue homogenate and serum TNF-α content changes (n=5)

*P<0.05，**P<0.01vsI/R group，##P<0.01vshippocampus; TNF-α: tumor necrosis factor-α; Sham: sham operation group; I/R:ischemia reperfusion group; MET: methoctramine; MA343: McN-A-343; CHO: choline.

2.2 组织和血浆中IL-1β浓度变化

I/R组海马、心、肺、肝、肾组织匀浆和血浆中IL-1β浓度均显著高于Sham组(海马、心、肺、肝、肾匀浆和血浆P均<0.01)。MET组及MA343组海马、心、肝、肾组织匀浆和血浆中IL-1β浓度均显著低于I/R组(海马、心、肺、肝、肾匀浆和血浆P均<0.01)。CHO组与/IR组相比，除海马匀浆中IL-1β的减少具有统计学意义(P<0.01)外，其余各组织及血浆IL-1β变化差异无统计学意义(P>0.05)。与I/R组相比，MET组、MA343组及CHO组中肺组织匀浆中IL-1β浓度减少，差异均无统计学意义(P>0.05)。

在I/R组中，与海马相比，心、肺、肝、肾组织匀浆及血浆IL-1β浓度差异有统计学意义(均P<0.01)，各组织间及血浆之间的差异统计学意义(P<0.05)，其IL-1β浓度高低依次为海马>血浆>肺>肝>心>肾(表2)。

表2 左海马、心、肺、肝、肾组织匀浆和血浆中IL-1β浓度变化

GroupHippocampusHeartLiverLungsKidneyBloodSham0.478±0.018**0.097±0.004**0.104±0.001**0.249±0.009**0.042±0.002*0.422±0.006**I/R1.262±0.0060.312±0.103##0.354±0.012##0.495±0.002##0.074±0.001##1.217±0.002##MET0.878±0.128**0.232±0.003**0.135±0.003**0.382±0.0130.064±0.001**0.784±0.008**MA3430.986±0.005**0.285±0.007**0.137±0.002**0.425±0.0030.063±0.003**0.874±0.002**CHO0.778±0.007**0.308±0.0040.363±0.0130.488±0.0030.073±0.0031.213±0.002

*P<0.05，**P<0.01vsI/R group；##P<0.01vshippocampus; IL-1β: interleukin-1β; Sham: sham operation group; I/R:ischemia reperfusion group; MET: methoctramine;MA343: McN-A-343; CHO: choline.

2.3 TUNEL法检测大鼠海马凋亡细胞阳性率

再灌注6 h后，肉眼观察Sham组大脑外观左右两侧对称，背侧表面血管呈淡红色，左右分布大体均一。I/R组可见双侧脑组织肿胀明显，脑组织发白。MET组、MCA343组及CHO组脑组织肿胀程度较I/R组有所减轻。

用TUNEL法检测凋亡细胞，本实验凋亡细胞为棕黄色的圆形或卵圆形致密块状(图1)。Sham组大鼠海马CA1区组织切片中可见极凋亡细胞(图1A)，I/R组大鼠海马组织切片中凋亡细胞散布于整个海马CA1区内(图1B)，而MET组、MCA343组及CHO组大鼠海马CA1区组织切片中凋亡细胞数明显少于I/R组(均P<0.01)(表3，图1C、D、E)。

图1 大鼠海马CA1区凋亡细胞Fig.1 Apoptotic cells of rat hippocampal CA1 area (TUNEL,200×)

A：sham group； B：I/R group； C：MET group； D：MA343 group； E：CHO group；Sham: sham operation group; I/R:ischemia reperfusion group; MET: methoctramine;MA343: McN-A-343; CHO: choline; TNF-α:tumor necrosis factor-α; IL-1β:interleukin-1β.

表3 各组大鼠海马CA1区凋亡细胞阳性率比较Tab.3 Positive rate of each rat hippocampal CA1 area apoptotic cells (n=5)

**P<0.01vsI/R group; Sham: sham operation group; I/R:ischemia reperfusion group; MET: methoctramine; MA343: McN-A-343; CHO: choline.

2.4 大鼠海马凋亡细胞阳性率与海马组织匀浆TNF-α、IL-1β浓度的关系

大鼠海马CA1区阳性细胞率的变化趋势与海马组织匀浆TNF-α、IL-1β浓度的变化相一致(表1、2，图2)。

图2 大鼠海马凋亡细胞阳性率与海马组织 匀浆TNF-α、IL-1β浓度的关系Fig.2 Relationship of rat hippocampal apoptotic cells rate positive with hippocampal tissue homogenate of TNF-α and IL-1β content

Sham: sham operation group; I/R:ischemia reperfusion group; MET: methoctramine;MA343: McN-A-343; CHO: choline;TNF-α:tumor necrosis factor-α; IL-1β:interleukin-1β.

3 讨论

3.1 胆碱能抗炎通路对脑缺血再灌注损伤的影响

Borovikova等[7]研究发现，致病菌入侵时，体内的迷走神经及其递质乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)与免疫系统相互作用，参与抗炎过程，并将之命名为“胆碱能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP)”。它可以被看作是一种神经免疫调节机制，当中枢收到机体受某种免疫刺激的信息后，就将这种信号投射到各迷走神经核团，激活传出迷走神经纤维，引起外周神经末梢释放ACh，与免疫细胞上具有α7亚单位的N型ACh受体结合，通过细胞内信号传导途径抑制促炎因子的释放，调控炎性反应[3,8]。

传出迷走神经能够抑制外周炎性反应因子的产生，提示迷走神经与炎性反应细胞间存在信号传导机制。在外周，ACh主要由交感神经的节前纤维、副交感神经节前和节后纤维释放，通过毒蕈碱型受体(M受体)和烟碱型受体(N受体) 发挥作用。外周血单核细胞表面存在M受体和N受体，两者均能与ACh结合，抑制TNF-α及IL-1β在体内的合成，但以N受体为主。

实验[9]证明，CAP可以抗炎。直接刺激迷走神经可降低内毒素休克大鼠血TNF-α浓度，减缓内毒素引起的低血压性休克的发生时相。内毒素血症时颈迷走神经放电频率明显升高。反之，切断迷走神经则使动物对内毒素的致死性效应更加敏感。Bernik等[10]也观察到电刺激迷走神经能减少缺血再灌注损伤所导致的全血TNF-α浓度升高，抑制心脏和肝脏TNF-α生成，缓解缺血再灌注引起的休克。CAP还可以抑制腹腔动脉缺血再灌注引发的NF-B活化和TNF-α表达增加。

以往的研究[8-10]CAP主要通过切断迷走神经来破坏CAP，观察炎性反应是否有扩大，或通过电刺激迷走神经及药物来达到刺激CAP的目的，验证炎性反应是否减轻。本实验应用M1受体激动剂McN-A-343、M2受体拮抗剂美索曲明(methoctramine)以及N型乙酰胆碱受体α7亚单位激动剂胆碱，这3种药物均能直接或间接提高Ach的浓度，相当于刺激CAP，观察药物刺激CAP后，是否能降低脑组织及全身TNF-α及IL-1β浓度。

胆碱能神经系统和固有的免疫系统之间吻合的分子，是一种对α-银环蛇毒敏感的巨噬细胞烟碱样乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor α7 subunit，α7 nAChR)。Shytle等[11]发现脑单核巨噬细胞——小神经胶质细胞上含有α7 nAChR，推测中枢也同外周一样，存在CAP。

本实验应用了α7 nAChR激动剂胆碱。胆碱是ACh被胆碱酯酶水解后的产物，可穿过血脑脊液屏障。本实验结果表明，与I/R组相比，胆碱显著降低了左海马组织匀浆的TNF-α及IL-1β浓度(P<0.01)，抑制海马TNF-α及IL-1β浓度的机制可能是胆碱直接与海马小胶质细胞上的α7 nAChR结合，与Shytle等[11]的推测相符合。而对血液、心、肝、肺、肾组织中的TNF-α及IL-1β含量影响不大。其原因可能包括：(1)胆碱半衰期过短，给药方式或给药时机的保护作用有限；(2)N型α7受体对于胆碱的失敏时间过短；(3)缺血再灌注损伤过于严重，对保护措施不敏感。是否其他方式或时机及更高浓度的胆碱是否会产生更强的保护效应仍有待于进一步探讨。

中枢和外周的毒蕈碱受体共有5种亚型(M1～M5)，脑组织中广泛分布着M1～M4亚型。M2受体主要分布于心脏、脑和平滑肌。自主神经元突触前膜上分布着M2受体，美索曲明是M2受体激动剂。激动M2受体抑制ACh的释放，而其拮抗剂美索曲明可抵消其负性调节，间接提高了ACh的浓度。M1受体分布在自主神经元突触后膜，可正性调节ACh的释放。McN-A-343可通过激动M1受体而促进ACh的释放。应用美索曲明和McN-A-343相当于刺激迷走神经，兴奋CAP。

本研究结果证实，侧脑室注射美索曲明及McN-A-343可降低脑缺血再灌注损伤中海马组织匀浆TNF-α及IL-1β的浓度。海马神经元突触前膜和突触后膜上分布α7 nAChR，也存在M1、M2受体。在体外利用放射-配体结合实验(radioligand-binding assay)中，α7 nAChR激动剂CNI-1493与M1受体高度特异性结合[12]。说明M1受体与N型乙酰胆碱受体α7亚单位复合物存在相互作用，中枢毒蕈碱受体(尤其M1受体)的活化，抑制TNF-α的释放。在本实验中，MET组与MCA343组相比，其海马TNF-α浓度差异有统计学意义(P<0.05)，美索曲明组海马TNF-α浓度高于McN-A-343组，支持M1受体对TNF-α浓度降低起主要作用。胆碱降低TNF-α的作用与其联合激动M1受体有关，或McN-A-343抑制TNF-α浓度也离不开N型乙酰胆碱受体α7亚单位的被激动。但目前本实验尚无法验证M1受体与N受体的联合作用。

本研究结果表明，胆碱、美索曲明和McN-A-343 3种药物均降低了中枢反应水平，说明中枢CAP存在的可能性。而美索曲明和McN-A-343这两种无法穿过血脑脊液屏障的大分子药物，却降低了外周组织和血浆炎性反应水平。其原因不是药物与迷走神经传出神经核团——迷走神经运动背核(dorsal motor nucleus of the vagus nerve，DMN)的受体相结合，通过刺激传出迷走神经而达到刺激外周CAP的目的。因为DMN上没有毒蕈碱受体的结合位点，推测其降低外周性反应的原因可能是：(1)中枢ACh直接释放入血，与外周血中的单核细胞和组织器官中的巨噬细胞相结合，减轻性反应？(2)可能与整合了交感神经的有关？CAP与下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA)轴在中枢水平具有广泛的联系[3]。延髓的迷走神经背侧复合体集中了重要的中枢迷走神经核团。其中孤束核(nucleus tractus solitaries, NTS)是重要组成部分，它与自主神经和内分泌功能均有关。NTS能将机体受到炎性反应侵害的信息传递到下丘脑核团，特别是室旁核(paraventricular nucleus of the hypothalamus, PVN)。PVN是促肾上腺皮质激素释放激素合成和释放的位置，可调节HPA轴的活性。这些机体结构和功能联系将神经抗炎和内分泌体液抗炎通路有效地结合起来。当CAP兴奋时，也同时激活了HPA轴，使其具有免疫抑制作用的终产物糖皮质激素释放增加，协同抗击机体的过度炎性反应。

3.2 脑缺血再灌注损伤后炎性细胞因子与细胞凋亡的关系

项洁等[12]实验发现在缺血再灌注脑损伤，凋亡神经元主要分布在脑梗死周围(即缺血半暗区)，与TNF-α的表达区域一致。在时间进程上，李力仙等[13]发现缺血侧半球皮质内TNF-α浓度于脑缺血再灌注后6 h明显升高。而细胞凋亡的高峰在再灌注24～48 h，这说明从TNF-α的表达到细胞凋亡需要时间过程。而胡建鹏等[14]则发现TNF-α与c-myc基因的表达高峰相同，推测TNF-α与细胞凋亡相关。本实验表明，MET组、MA343组及CHO组中大鼠海马凋亡细胞阳性率的降低与TNF-α的降低趋势一致，与上述结论相符合。IL-1β可通过增加细胞内Ca2+的浓度，继而激活其靶酶，引起神经元的损伤和凋亡[15]。本实验MET组、MA343组及CHO组中大鼠海马凋亡细胞阳性率的降低与IL-1β的降低趋势一致。

本实验中，TNF-α及IL-1β浓度的降低，与激活CAP有关。而凋亡细胞阳性率随TNF-α及IL-1β含量的降低而降低，可以说CAP间接抑制了凋亡，减轻了脑缺血再灌注损伤。

综上所述，CAP对脑缺血再灌注引发的局部和全身的炎性反应均具有保护作用，并间接降低了凋亡细胞阳性率。其机制与活化CAP，提高ACh的浓度，减少TNF-α及IL-1β产生有关。

[1] Pulsinelli W A, Brierley J B. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat[J]. Stroke, 1979, 10(3):267-272.

[2] Iadecola C, Alexander M. Cerebral ischemia and inflammation[J]. Curr Opin Neurol, 2001, 14(1)：89-94.

[3] Pavlov V A, Wang H, Czura C J, et al. The cholinergic anti-inflammatory pathway: a missing link in neuroimmunomodulation[J]. Mol Med, 2003, 9(5-8): 125-134.

[4] Tracey K J. The inflammatory reflex[J]. Nature, 2002, 420(6917): 853-859.

[5] Tracey K J, Czura C J, Ivanova S. Mind over immunity[J]. FASEB J, 2001, 15(9): 1575-1576.

[6] Czura C J, Friedman S G, Tracey K J. Neural inhibition of inflammation: the cholinergic anti-inflammatory pathway[J]. J Endotoxin Res, 2003, 9(6): 409-413.

[7] Borovikova L V, Ivanova S, Zhang M, et al. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin[J]. Nature, 2000, 405(6785): 458-462.

[8] Czura C J, Friedman S G, Tracey K J. Neural inhibition of inflammation: the cholinergic anti-inflammatory pathway[J]. J Endotoxin Res,2003, 9(6):409-13.

[9] 黄健,杨志焕.内毒素血症大鼠颈迷走神经传出放电变化[J].第三军医大学学报,2005,27(9):850-852.

[10]Bernik T R, Friedman S G, Ochani M, et al. Cholinergic anti-inflammatory pathway inhibition of tumor necrosis factor during ischemia reperfusion[J]. J Vasc Surg, 2002, 36(6): 1231-1236.

[11]Shytle R D, Mori T,Townsend K, et al. Cholinergic modulation of microglial activation by α7 nicotinic receptors[J]. J Neurochem, 2004,89(2):337-343.

[12]项洁，沈霞，耿德勤．肿瘤坏死因子-α在大鼠脑缺血再灌注中的表达及对神经细胞凋亡的影响[J]．中国临床康复，2004, 8(28)：6094-6095.

[13]李力仙,朴明学,江涛,等.大鼠脑缺血再灌注后缺血侧半球皮质与缺血核心区皮质TNF-α含量的对比研究[J].中国急救医学，2002，22(6)：318-319.

[14]胡建鹏,王键,吕磊,等. 局灶性脑缺血再灌注时神经元、胶质细胞形态变化与TNF-α、c-Myc表达相关的实验研究[J]. 中国病理生理杂志,2004，20(7)：1251-1255.

[15]王文鑫，王胜宝，束旭俊，等.刺激迷走神经对大鼠缺血性脑损伤保护作用的初步研究[J].中国脑血管病杂志，2014，11(6)：317-322.

编辑 慕 萌

Effect of cholinergic anti-inflammatory pathway on cerebral ischemia-reperfusion injury in the rat

Wang Xiao, Su Yue, Li Tianzuo, Zhao Binjiang*

(DepartmentofAnesthesiology,CapitalMedicalUniversity,BeijingShijitanHospital,Beijing100038,China)

Objective To investigate the protective effect of cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) via the M1 receptor agonist,the M2 receptor antagonist and the nAChR7 agonist. during cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Twenty-five male healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into five equal groups: sham operation (Sham) group, ischemia reperfusion (I/R) group, methoctramine (MET) group, McN-A-343(MA343) group and choline(CHO) group. Rats were subjected to four-vessel occlusion (4-VO) global cerebral ischemia.by electrocauterization of the bilateral vertebral arteries, except Sham group. 15 min before ischemia-reperfusion, we administered intracerebroventricularly (i.c.v.) Methoctramine(500 ng/kg,10 μL), McN-A-343(500 ng/kg,10 μL) and Choline(500 ng/kg,10 μL) to MET group, MA343 group and CHO group, other groups receiving saline (0.9%). Then forebrain ischemia was induced by tightening of the clasps that around the common carotid arteries for 20 minutes, except Sham group. Blood and tissue samples were collected after reperfusion for 6 h in all groups. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) levels of hippocampus, heart, liver, lung,kidney and plasma were measured by radio-immunoassay(RIA).Apoptosis was detected by terminal deoxynucleotidyl-trallsferase meiated dUTP nick end labeling(TUNEL). Results Methoctramine and McN-A-343 could markedly inhibit the increase of TNF-α and IL-1βcontent in hippocampus, heart, liver, kidney and plasma after ischemia.Choline could also attenuated TNF-α and IL-1βexpression in hippocampus but could not inhibit them in heart, liver, kidney and serum. TNF-α and IL-1β levels in lung could not be suppressed by methoctramine, McN-A-343 or choline. Compared with I/R, the apoptotic cells in MET group, MA343 group and CHO group were significantly decreased. Conclusion It is indicated that CAP plays a potential role in alleviating local and systemic inflammatory response during cerebral ischemia-reperfusion injury. The mechanisms of anti-inflammatory were likely to suppress the expression of TNF-α and IL-1β.

cholinergic anti-inflammatory pathway; vagus nerve; cerebal ischemia-reperfusion; tumor necrosis factor-α(TNF-α); interleukin-1β(IL-1β); methoctramine; McN-A-343; choline

国家自然科学基金(8157050441)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (8157050441).

时间：2017-06-09 17∶26 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20170609.1726.010.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.03.003]

R743.31

2016-01-15)

*Corresponding author， E-mail：zhaobinjiang@sina.com