七氟烷与高浓度氧对老年小鼠海马caspase-3的表达及认知功能的影响

陈 玢 刘 伟 史志国 刘 涛 郑 晖

(1.首都医科大学附属北京胸科医院麻醉科，北京 101149；2.国家癌症中心/中国医学科学院 北京协和医学院 肿瘤医院麻醉科，北京 100021)

· 麻醉学与神经科学 ·

七氟烷与高浓度氧对老年小鼠海马caspase-3的表达及认知功能的影响

陈 玢1刘 伟1史志国1刘 涛1郑 晖2*

(1.首都医科大学附属北京胸科医院麻醉科，北京 101149；2.国家癌症中心/中国医学科学院 北京协和医学院 肿瘤医院麻醉科，北京 100021)

目的 探讨七氟烷与高浓度氧对老年小鼠海马半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表达及认知功能的影响。方法 健康雄性C57/BL6老年小鼠(14月龄)33只，采用数字表法将其随机分为3组：高浓度氧组(HO组，n=11)：吸100%(体积分数)氧4 h；高浓度氧+七氟烷组(HS组，n=11)：吸100%(体积分数)氧+2.5%(体积分数)七氟烷4 h；对照组(Con组，n=11)：吸空气4 h。24 h后采用Morris水迷宫法研究3组小鼠麻醉后连续 5 d找到平台所用的时间(逃避潜伏期)和第5天去除平台后，90 s内穿过原平台的次数。利用蛋白质印记(Western blotting)法检测小鼠海马caspase-3的表达。结果 与Con组相比，HO组的caspase-3表达差异无统计学意义(P>0.05)；HS组的穿越平台次数降低(P=0.023)，caspase-3表达显著增加(P=0.036)。结论 吸入100%(体积分数)氧对老年小鼠认知功能无影响，2.5%(体积分数)七氟烷与100%(体积分数)氧同时吸入增加老年小鼠海马caspase-3的表达，与老年小鼠产生认知功能障碍有关。

老年小鼠；认知功能障碍；七氟烷；氧气；半胱氨酸蛋白酶-3

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是术后一种常见的合并症。有研究[1]表明，七氟烷可以引起短暂的术后认知功能障碍。近期研究[2]表明，七氟烷可以诱导β淀粉样蛋白(amyloid β,Aβ)形成，继而激活半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)。Aβ在突触前的积聚影响突触前蛋白突触素和突触后蛋白(postsynaptic density protein -95,PSD-95)的表达，从而产生认知功能缺陷[3]。Ulue等[4]的研究表明吸入高浓度氧可以导致发育期脑细胞死亡，从而产生认知功能障碍，而吸入高浓度氧对成年脑细胞的作用还有待研究。本研究通过探讨七氟烷和高浓度氧同时吸入对老年小鼠认知功能的影响，为防止术后认知功能障碍的发生提供思路。

1 材料与方法

1.1 动物选择与分组

健康雄性C57/BL6老年小鼠33只，14月龄，体质量200～300 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK(京)2011-0011。老年小鼠饲养在温度控制在22 ℃～23 ℃且昼夜平分的屋子里，可随意摄取标准鼠粮和水。采用数字表法将其随机分为3组，高浓度氧组(HO组，n=11)：吸100%(体积分数)氧4 h；高浓度氧+七氟烷组(HS组，n=11)：吸100%(体积分数)氧+2.5%(体积分数)七氟烷4 h；对照组(Con组，n=11)：吸空气4 h。

1.2 麻醉方法

3组老年小鼠置于特制的麻醉箱内，保持自主呼吸，用Datex-Ohmeda麻醉机进行吸入麻醉和吸氧，麻醉过程中用Datex-Ohmeda监护仪连续监测麻醉药和氧浓度，用加热垫将麻醉箱内的温度保持在(37.0±0.5) ℃。麻醉过程中3组的气体流量保持一致且为4 L/min，七氟烷浓度达到2.5%时开始计时4 h。

1.3 行为学测试

采用Morris水迷宫进行测试。Morris水迷宫实验装置为一圆形水池，直径100 cm，高50 cm，水深30 cm；池壁上以4个等距离点即东、南、西、北将水池平均分为4个象限，在西南象限中央离池壁25 cm处放置平台(平台与池壁、圆心距离相等)，平台直径9 cm，高29 cm，没于水面下1 cm。每个象限池壁的中点为动物入水点，水池周围设有参照物且保持不变。池壁为黑色，池水中加入钛白粉至看不到平台。水温保持21 ℃～23 ℃，房间内光照恒定。定位航行实验历时5 d，每天训练4次，将小鼠分别从4个不同起始点面向池壁放入水中，限时90 s，记录逃避潜伏期(小鼠找到平台所用的时间)和游泳速度，取平均值为当天的测试结果。最后一次定位航行实验结束后行空间探索实验，去除平台，然后取距离平台最远的那个点将小鼠放入水池中，记录小鼠90 s内穿越原平台次数。

1.4 Western blotting检测海马caspase-3的表达

取海马组织匀浆，离心后取上清液，经BCA蛋白定量后，-80 ℃保存备用。样品中加入上样缓冲液，于沸水中煮10 min使蛋白变性；8%/10%(质量分数)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白；电转移至硝酸纤维素膜上；5%(质量分数)脱脂奶粉室温封闭1 h,加入1：5 000稀释的兔源的caspase-3抗体，4 ℃孵育过夜；次日1‰TBST洗涤3次×5 min/次，羊抗兔HRP标记的抗体室温孵育1 h，1‰TBST洗涤3次×5 min/次，增强化学发光法(enhanced chemiluminescence,ECL)显色，曝光。

1.5 统计学方法

2 结果

Morris水迷宫法记录Con组、HO组和HS组小鼠的逃避潜伏期和第5天90 s内穿越原平台次数，见表1、图1～3。与Con组相比，HO组和HS组的逃避潜伏期差异无统计学意义(P=0.875)，而HS组的穿越平台次数显著减少，3组比较，差异有统计学意义(P=0.041)。

表1 3组小鼠Morris水迷宫测试指标的比较

GroupDayEscapelatency/sPlatformcrossingnumbersConD158.24±20.19D244.17±28.70D337.08±30.82D432.80±24.81D534.15±22.303.64±3.01HOD169.15±21.55D253.26±26.29D344.71±29.99D437.76±25.11D542.14±25.103.08±2.07HSD166.48±11.86D259.11±8.26D364.21±27.97D451.30±8.36D549.33±9.561.2±0.79

Con:control; HO:high concentration of oxygen; HS:high concentration of oxygen+sevoflurane.

Western blotting法检测caspase-3在小鼠海马区域的表达。与Con组相比，HS组caspase-3的表达显著增加。

图1 3组小鼠逃避潜伏期的比较Fig.1 Comparison of escaping time among three groups

Con:control; HO:high concentration of oxygen; HS:high concentration of oxygen+sevoflurane.

图2 3组小鼠穿越平台次数的比较Fig.2 Comparison of amounts of crossing the platform among three groups

*P<0.05vsCon group,#P<0.05vsHO group，P<0.05 compared among three groups.Con:control; HO:high concentration of oxygen; HS:high concentration of oxygen+sevoflurane.

图3 3组小鼠caspase-3表达Fig.3 Comparison of caspase-3 expression among three groups

*P<0.05vsCon group,#P<0.05vsHO group,P<0.05 compared among three groups. Con:control; HO:high concentration of oxygen; HS:high concentration of oxygen+sevoflurane.

3 讨论

1955年，Bedford[5]首次报道了POCD,他对5年内1 193例全身麻醉后老年病人进行回顾性调查发现，接近10%的老年病人术后存在认知功能障碍。1982年，Savageau等[6]首次发现了POCD、手术和麻醉之间的联系。POCD的发生率取决于手术类型、年龄、术前并存疾病和术前认知功能的情况。目前，POCD的国际研究组织对实施非心脏手术的1 218位老年病人进行了国际上最大的关于POCD的多中心研究。研究[7]表明，术后1周的发生率为26%，术后3个月为10%，术后两年为1%。相反，利用体外循环实施心脏手术的病人术后1周的发病率为53%，之后5年的发病率仍然为42%。POCD的发病率如此之高，引起学术界的广泛关注。有研究[8]表明老龄是POCD发生的独立危险因素，本研究正是使用老年小鼠，从动物行为学、海马区域蛋白质表达水平两方面，分别运用Morris水迷宫法和Western blotting法探讨七氟烷和高浓度氧相互作用对老年小鼠认知功能的影响。

现在普遍认为细胞凋亡是一系列高度调控的半胱氨酸蛋白酶(caspase)级联反应事件的结果, caspase- 3被证实处于该级联反应的下游, 它通过降解细胞内相应底物使细胞死亡,其他下游的caspase 成员可能是凋亡事件的真正执行者。β位淀粉样前蛋白(amyloid precursor protein，APP)是一种广泛存在于各类细胞的单链跨膜糖蛋白, 它可以被caspase-3 剪切, 其蛋白水解产物聚合形成Aβ, Aβ不但出现在老年斑内, 而且还可诱导caspase-3 激活, 促使细胞发生凋亡, 因此推测caspase-3 可能与POCD 的发生有关。有研究[2，9]表明，异氟烷、七氟烷都可以诱导Aβ形成，继而激活caspase-3。本研究正是采用caspase-3来反应POCD的发生。

七氟烷是目前临床中最常用的吸入麻醉药，而且与异氟烷相比，七氟烷有较小的毒性，并且有研究[10]已经显示七氟烷可以激活特定的酶继而引起tau蛋白的磷酸化产生认知功能障碍，也有研究[11]显示七氟烷使C/EBP同源蛋白和caspase-12的表达增加，内质网应激反应从而引起老年鼠神经元细胞凋亡、神经退行性变和认知功能缺陷。本研究表明七氟烷与高浓度氧同时吸入时，老年小鼠海马caspase-3的表达水平显著增多，认知功能降低。这表明七氟烷引起的认知功能缺陷与细胞凋亡有关。但也有研究[12]表明实施4 h的七氟烷麻醉不会影响成年鼠和老年鼠的获得性学习记忆力，这有可能是由于使用的七氟烷浓度不同而导致的。之前有研究[13]表明七氟烷引起的短暂认知功能损伤是呈剂量依赖性的，与正常0.9%(质量分数)氯化钠注射液组相比，1.5%(体积分数)七氟烷麻醉后认知功能无改变，而3%(体积分数)七氟烷麻醉后认知功能显著降低。

七氟烷可以引起细胞凋亡及认知功能缺陷，同时高浓度氧引起机体的氧化应激、影响脑内平衡、导致脑细胞坏死，两者同时吸入时，笔者推测也许产生协同作用。本研究结果表明，七氟烷与高浓度氧同时吸入时，增加海马caspase-3的表达水平，且产生认知功能损伤。Chen等[11]的研究比较了单纯吸入21%(体积分数)氧和七氟烷与高浓度氧同时吸入的成年与老年大鼠的认知功能，结果表明七氟烷与高浓度氧同时吸入时产生内质网应激反应，C/EBP同源蛋白和caspase-12的表达增加，神经元细胞凋亡、神经退行性变和认知功能缺陷。还有研究[13-15]表明3%(体积分数)七氟烷与氧同时吸入时，通过抑制海马M1型乙酰胆碱受体mRNA的表达，从而引起短暂的认知功能障碍。以上研究得到的认知功能缺陷的结果与本研究是一致的，但所测因子不同，说明七氟烷与氧同时吸入所导致的认知功能缺陷机制是复杂的，还需要更全面的实验才能完全阐明。

本研究发现七氟烷和高浓度氧同时吸入可以使老年小鼠认知功能降低，但本研究仍存在一些局限性。首先，仅研究了七氟烷与高浓度氧同时吸入对认知功能的影响，在未来的研究中还需要考虑七氟烷与不同浓度氧，不同浓度七氟烷与相同浓度氧同时吸入对认知功能的影响。其次，由于时间原因，仅研究了七氟烷和高浓度氧同时吸入对老年小鼠短期认知功能的影响，未来还需要进一步的实验决定对长时程认知功能的影响。

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编辑 慕 萌

Impact of sevoflurane and high concentration of oxygen on expression of caspase-3 and cognition of aged mice

Chen Bin1, Liu Wei1, Shi Zhiguo1, Liu Tao1, Zheng Hui2*

(DepartmentofAnesthesiology,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China; 2.DepartmentofAnesthesiology,NationalCancerCenter/CancerHospital,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100021,China)

Objective To investigate the impact of sevoflurane and high concentration of oxygen on expression of caspase-3 and cognitive function of aged mice. Methods Thirty three healthy male C57/BL6 elderly mice (14 months) were randomly divided into three groups: group of high concentration of oxygen (HO group,n=11): inhaling 100% oxygen for 4 h; high concentration of oxygen + sevoflurane group (HS group,n=11): taking in 100% oxygen with 2.5% sevoflurane for 4 h; control group (Con group,n=11): taking in air for 4 h. Cognitive function in the elderly mice was tested in the Morris water maze. Western blotting is used to test the expression of caspase-3 in hippocampus. Results Compared with Group Con, Group HO saw no difference in numbers of crossing the platform and Caspase-3 expression. Group HS crossed the platform less (P=0.023)，and the caspase-3 expression of the group increased significantly(P=0.036).Conclusion Inhaling 100% oxygen had no impact on cognitive function in the elderly mice;Inhaling 2.5% Sevoflurane with 100% oxygen could increase expression of caspase-3, and it had close relations with the cognitive dysfunction of the aged mice.

elderly mice; cognitive dysfunction; sevoflurane; oxygen; caspase-3

国家自然科学基金(81371202)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81371202).

时间：2017-06-09 17∶07 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20170609.1707.002.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.03.004]

R614

2017-03-20)

*Corresponding author， E-mail：zhenghui0715@hotmail.com