男性不育患者精液中血管内皮生长因子及其受体Flt-1的表达研究*

焦瑞宝唐吉斌冯恒孝刘志宏姚余有

1. 安徽省铜陵市人民医院（铜陵 244009）；

2. 铜陵市义安区血吸虫防治站；3. 安徽医科大学公共卫生学院

男性不育患者精液中血管内皮生长因子及其受体Flt-1的表达研究*

焦瑞宝1唐吉斌1冯恒孝1刘志宏2姚余有3

1. 安徽省铜陵市人民医院（铜陵 244009）；

2. 铜陵市义安区血吸虫防治站；3. 安徽医科大学公共卫生学院

目的 研究男性不育患者精液中血管内皮生长因子（VEGF）及其受体1（Flt-1）的表达情况，探讨两者在精子发生和成熟中的作用。方法 在完成男性不育患者精液计算机辅助分析后，选择性收集120例患者精液标本1mL置于-80℃冰箱保存， VEGF和Flt-1均采用ELISA试剂盒检测。结果 研究对象中少精子症组的VEGF为（154.16±151.46）ng/L，与对照组（253.42±60.02）ng/L比较，t =2.490，差异有显著性（P＜0.05）；经Pearson相关性分析，Flt-1与VEGF呈正相关（r =0.675，P＜0.01）。结论 男性不育患者精浆中VEGF含量降低可能引起精子发生减弱，VEGF及其受体Flt-1的表达改变可影响精子运动特征。

不育, 男性; 血管内皮生长因子类; 精子能动性

血管内皮生长因子（Human vascular endothlial growth factor, VEGF）可由多种正常细胞和肿瘤细胞分泌，能高度特异性地作用于血管内皮细胞，以受体介导的方式发挥其生物学作用[1]。血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）又称为fms样酪氨酸激酶（fms-like tyrosine kinase-1, Flt-1），近年来有研究显示[2,3]：VEGF和Flt-1均可表达于包括睾丸Sertoli细胞和Leydig细胞等许多与生殖有关的细胞，并调节生殖系统各器官的血管生成和通透性，是体内与生殖有关的重要生长因子之一。但两者与精子质量参数的关系，国内外少有报道。本文以我院就诊的男性不育患者为研究对象，分别检测患者精液Flt-1以及精浆VEGF，探讨其与精子质量参数的关系，旨在研究其在男性不育中的作用。现报道如下。

材料与方法

一、研究对象

选择性收集中医男科、泌尿外科门诊的男性不育患者120例，年龄为21~46岁，不育时间1~25年，就诊时间为2014年8月至2016年3月。排除精液部分丢失、白细胞精液症患者，排除泌尿生殖系统肿瘤患者资料。把120例男性不育患者分为4组：无精子症组18例（精子浓度为0），少精子症组25例（精子浓度＜15×106/mL），正常浓度组57例（精子浓度在15~213×106/mL），浓度过高组20例（精子浓度＞213×106/mL），诊断标准参照《全国临床检验操作规程》（第4版）[4]和第5版《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》[5]。涉及精子运动参数评价时，排除无精子、死精子和严重少、弱精子症患者，并设正常对照组20例，均来自医院产科门诊、自然受孕的孕妇丈夫。

二、试剂与仪器

精液VEGF和Flt-1的ELISA法试剂盒（只限科研用）购自南京建成生物公司。精液白细胞过氧化酶正甲苯胺染色试剂盒购自深圳市华康试剂公司。洗板机、酶标仪均由深圳市汇松公司生产，精子质量分析系统由江苏省捷达公司生产。

三、实验方法

（一）精液采集

精液标本以手淫法采集，禁欲3~7d，将一次射出的全部精液采集于干净、带有刻度的容器内；容器加盖，并标明标本采集日期、时间、禁欲天数。精液采集后立即于20℃~35℃条件下保温，并在1h内送检。

（二）精液分析

实验室收到标本后，立即置于37℃恒温水浴箱中，定时观察精液液化状态。等液化后，记录精液的液化时间和精液量，并测定pH值；混匀全份精液后，取5μL精液置于计算机辅助精子质量分析系统计数盘中进行精子质量分析，检测参数包括精液量、精子浓度、精子总活力、前向运动率，以及反映精子运动特征参数包括平均路径速度（VAP）、曲线速度（VCL）、直线速度（VSL）、精子头侧摆幅度（ALH）、鞭打频率（BCF）、平均角位移（MAD）、直线性（LIN）、摆动性（WOB）、前向性（STR）[6]。白细胞过氧化酶正甲苯胺染色排除白细胞精液症患者，完成精液分析后收集1mL精液置于-80℃低温冰箱保存，以便集中检测Flt-1和VEGF。

（三） Flt-1和VEGF测定

1. Flt-1测定设5个标准品，浓度分别为1.5 ng/ mL、3 ng/mL、6 ng/mL、12 ng/mL、24ng/mL；VEGF测定设5个标准品，浓度分别为75 ng/L、150 ng/L、300ng/L、600ng/L、1200ng/L；

2. Flt-1测定使用混匀后精液40μL，而VEGF测定使用离心后精浆40μL，其余操作参照试剂盒说明书。

（四） 统计学处理

数据处理运用SPSS 19.0统计软件，计量资料采用x±s表示，两组间比较采用t检验，组间多重比较采用单因素ANOVA方差分析，两组资料的相关性分析采用Pearson分析，用相关系数（r）表示，采用多元线性相关回归分析单因素与多组参数相关性，检验水准：α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、男性不育患者精子浓度与精液中VEGF、Flt-1的关系分析

结果见表1。病例组中少精子症组的VEGF为（154.16±151.46）ng/L，与正常对照组（253.42±60.02）ng/L比较，t=2.490，差异有统计学意义（P＜0.05）；其他病例组与正常对照组比较，差异均没有统计学意义（P＞0.05）。病例各组与正常对照组Flt-1比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 男性不育患者精子浓度与VEGF、Flt-1的关系分析（n=120）

二、 男性不育患者精子前向运动率（PR）与精液中VEGF、Flt-1的关系分析

由表2可见，排除无精子症组和严重少精子症组患者共26例，余下94例研究对象按精子前向运动率（PR）分为4组，其中PR＜20%组的VEGF低于其他3个病例组和正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。病例4组的Flt-1与正常对照组比较，差异均没有统计学意义（P＞0.05）。

表2 精子前向运动率（PR）与VEGF、Flt-1的关系分析（n=94）

三、病例组的Flt-1与VEGF的线性相关和回归分析

经Pearson相关性分析，120例病例组的Flt-1与VEGF呈正相关（r =0.675，P＜0.01），线性回归方程为Ŷ =0.862+0.012X。

四、两组精液中VEGF、Flt-1含量与年龄、常规参数的多元线性回归分析

病例组分析结果见表3，排除无精子症患者18例，VEGF与精子浓度、精子总数呈正相关（P＜0.05）；与年龄、精液量、精子总活力和PR均无相关（P＞0.05）。正常对照组分析结果见表4，VEGF、Flt-1与患者年龄、精液量、精子浓度、精子总数、精子总活力和PR均无相关（P＞0.05）。

五、两组精液中VEGF、Flt-1与精子运动特征参数的多元线性回归分析

病例组分析结果见表5，排除无精子症和严重少弱精子症患者26例，94例研究对象进行多元线性回归分析显示，VEGF与VAP和MAD呈正相关，与BCF呈负相关（P＜0.05）。

表3 病例组VEGF、Flt-1与患者年龄、精液常规参数的多元线性回归分析（n=102）

表4 正常对照组VEGF、Flt-1与患者年龄、精液常规参数的多元线性回归分析（n=20）

表5 病例组VEGF、Flt-1与精子运动特征参数的多元线性回归分析（n=94）

Flt-1与VAP和MAD呈正相关，与ALH、BCF呈负相关（P＜0.05）。

正常对照组分析结果见表6，VEGF和Flt-1与VAP、VCL、VSL、ALH、BCF、MAD、WOB、LIN和STR均无相关（P＞0.05）。

表6 正常对照组VEGF、Flt-1与精子运动特征参数的多元线性回归分析（n=20）

讨 论

睾丸内精子发生主要受下丘脑-垂体-睾丸性腺轴的调控，另外也受到睾丸和附睾内环境以及机体一些细胞生物因子的影响。近年来，大鼠动物实验表明[7]：在睾丸的各级生精细胞、Sertoli细胞和Leydig细胞内，均有VEGF表达。

本研究按精子浓度分组，从少精子症到浓度正常组，VEGF含量增多，且少精子症组的VEGF含量与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。VEGF与患者精液常规参数的多元线性回归分析显示，VEGF与精子浓度、精子总数呈正相关（P＜0.05）。另外，本研究还按精子PR分4组比较，伴随着PR增加，VEGF含量在增加，但差异没有统计学意义（P＞0.05），这说明精子发生可能与VEGF表达有关，而无精子症产生可能是由于染色体、生精功能障碍或输精管道梗阻等造成的[8]。

VEGF的生物学效应是通过其特异性的膜受体介导实现的，其中VEGFR1又称为Flt-1[9]。本研究显示，Flt-1与VEGF呈正相关（r =0.675，P＜0.05），线性回归方程为Ŷ =0.862+0.012X。本研究显示：男子不育4个病例组的Flt-1与正常对照组比较，差异均没有统计学意义（P＞0.05）。多元线性回归分析显示病例组和正常对照组的Flt-1与患者年龄、精液量、精子浓度、精子总数、精子总活力和PR均无相关（P＞0.05）。

睾丸内产生的精子是在进入附睾后逐渐发育成熟的。附睾头部的精子运动很弱，速度很慢，且直线性很差；到了附睾体部，精子运动明显增强，表现为速度和直线性都有明显增加，附睾尾部精子在体外可像正常射出的精子一样向前运动[10]。艾庆燕等[7]对大鼠进行免疫组化染色发现：VEGF蛋白几乎表达于附睾管上皮所有主细胞胞质中，呈粗大的阳性颗粒，而主细胞可合成和分泌多种特异成分，为精子成熟及储存提供适宜的微环境；且VEGF在附睾体部表达最强，头部次之，尾部和始段表达较弱。本研究中在进行VEGF与精子运动特征参数的线性多元回归分析时发现：男性不育患者精液中VEGF与VAP和MAD呈正相关，与BCF呈负相关（P＜0.05）；而正常对照组VEGF与精子运动特征参数均无相关（P＞0.05）；Lyibozkurt 等[11]体外实验也发现：当VEGF浓度达到15ng/mL时，可显著提高精子总活力、PR、VCL和STR运动特征参数。艾庆燕等[7]还发现：Flt-1蛋白表达于上皮细胞主细胞的核上部胞质内，阳性染色以附睾头部最强，尾部远段次之，近段较弱，体部上皮阴性；本研究对男性不育症组Flt-1与精子运动特征参数进行多元线性回归分析发现：Flt-1与VAP和MAD呈正相关，与ALH、BCF呈负相关（P＜0.05）；而正常对照组的Flt-1与精子运动特征参数均无相关（P＞0.05）。

因此我们认为睾丸中VEGF含量可能与精子发生有关，而附睾上皮主细胞分泌的VEGF 和Flt-1蛋白，影响着附睾管腔液的组成、精子成熟的微环境以及精子运动能力获得等睾丸后的成熟过程。

1 艾庆燕, 赵豫凤, 杨加周, 等. 精索静脉曲张对青春期大鼠睾丸中VEGF和Flt-1蛋白表达的影响. 中国组织化学与细胞化学杂志 2012; 21(3): 236-239

2 Lu N, Sargent KM, Clopton DT, et al. Loss of vascular endothelial growth factor A(VEGFA) is forms in the testes of male mice causes subfertility, reduces sperm numbers, and alters expression of genes that regulate undifferentiated spermatogonia. Endocrinology 2013; 154(12): 4790-4802

3 Lee TC, Ho HC. Effects of prostaglandin E2 and vascular endothelial growth factor on sperm might lead to endometriosis-associated infertility. Fertil steril 2011; 95(1): 360-362

4 尚红, 王毓三, 申子瑜 .全国临床检验操作规程. 北京:人民卫生出版社, 第4版, 2015; 191

5 世界卫生组织. 世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册. 人民卫生出版社, 第5版, 2011; 193

6 焦瑞宝, 唐吉斌, 冯恒孝, 等.代谢综合征与男性不育症的关系研究. 中国男科学杂志 2015; 29(9): 37-41

7 艾庆燕, 田宏, 张洁, 等. 血管内皮生长因子和其受体Flt-1在青春期大鼠睾丸、附睾及附睾内精子上的表达研究. 中华男科学杂志 2008; 14(10): 871-875

8 聂群, 俞冬熠, 韩美艳, 等. 无精子及少精子症患者染色体及生殖激素水平分析. 中国男科学杂志 2016; 30(3): 38-41

9 孙鹏, 郭玉刚, 秦文波, 等. 高脂血症大鼠阴茎海绵体中VEGF含量变化对NOS的影响. 中国男科学杂志 2010; 24(10): 21-24

10 龚坚, 刘朝圣. 附睾微环境对精子成熟影响的研究进展.

中国男科学杂志 2016; 30(2): 69-72

11 Lyibozkurt AC, Balcik P, Bulgurcuoglu S, et al. effect of vascular endothelial growth factor on sperm motility and survival. Reprod BioMed Online 2009; 19(6): 784-788

（2016-10-28收稿）

Expressions of vascular endothelial growth factor and its receptor Flt-1 in semen of male infertility*

Jiao Ruibao1, Tang Jibin1, Feng Hengxiao1, Liu Zhihong2, Yao Yuyou3
1.Anhui Province Tongling People's Hospital, Tongling 244009, Anhui, China;
2. Tongling Yi'an Area Schistosomiasis Control Station; 3.Public Health College of Anhui Medical University

Objective To explore the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor Flt-1 in semen of male infertility and their roles in spermatogenesis and sperm maturation.Methods Semen analysis was performed using computer-aided detection system, and then 120 semen specimens of male infertility patients were collected selectively and preserved in -80℃ refrigerator. The expressions of VEGF and Flt-1 were detected by ELISA.Results The expression of VEGF in asthenozoospermia group was (154.16±151.46)ng/L, while the expression of which in control group was (253.42±60.02) ng/L, the difference was statistically signi fi cant (P<0.05). Correlation coef fi cient r of Flt 1 and VEGF was equal to 0.675, correlation analysis showed a signi fi cant difference (P<0.01).Conclusion Lower VEGF levels in male infertility might cause less Spermatogenesis, the expression of VEGF and its receptor Flt-1 could affect the characteristics of sperm motility.

infertility, male; vascular endothelial growth factors; sperm motility

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.01.005

R 698.2

*本课题受安徽省铜陵市卫计委科研项目（卫科研[2014]28号）基金资助